響應(yīng)曲面法優(yōu)化喜樹堿的超聲提取工藝

康大力，沈小鐘，張洪利＊（.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣州 5050；.廣東省中藥研究所，廣州 5050）

喜樹（Camptotheca acuminata）為珙桐科喜樹屬植物，為我國(guó)南方特有品種。1966年，Wall等［1］首次從喜樹中提取并鑒定出具有抗腫瘤活性的生物堿成分喜樹堿（camptothecin），并于20世紀(jì)70年代開始了喜樹堿的臨床研究。迄今為止，喜樹堿類抗癌藥物仍是唯一一類上市的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ阻斷劑。irinotecan和topotecan這2種喜樹堿衍生物已被批準(zhǔn)上市用于多種癌癥的治療［2］。目前，喜樹堿衍生物的獲得主要從喜樹原植物中直接分離提取或由喜樹堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾得到。

由于天然材料中化學(xué)成分復(fù)雜，次生代謝產(chǎn)物的含量較低，因此，必須優(yōu)選簡(jiǎn)便、高收率的提取方法，并建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)方法，以滿足次生代謝產(chǎn)物研究的需要。近年來(lái)，超聲提取逐漸成為新興起的一種提取方法，超聲波具有空化、攪拌、粉碎等作用，可以破壞細(xì)胞壁，使溶劑進(jìn)入到細(xì)胞中充分溶解有效成分，與傳統(tǒng)提取方法比，具有時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、不需要加熱等特點(diǎn)［3］。本文采用響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化喜樹堿的提取方法，通過對(duì)響應(yīng)面的分析優(yōu)選最佳工藝，利用其直觀、高效、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)［4－6］，考察溫度、時(shí)間、料液比等因素對(duì)喜樹堿提取率的影響，為喜樹堿及其衍生物生產(chǎn)提供研究基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜系統(tǒng)（Waters公司，美國(guó)），配備DAD檢測(cè)器，色譜柱為C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex 110A）。

1.2 試藥 藥材采集于廣東省中藥研究所中藥標(biāo)本園，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)峨嵋學(xué)院劉曉春副教授鑒定為珙桐科喜樹屬植物喜樹（Camptotheca acuminata Decne.）的果實(shí)；用自來(lái)水洗凈，室溫下陰干，粉碎，于45℃烘干至恒質(zhì)量；乙腈（色譜純，天津市協(xié)和昊鵬色譜科技有限公司，批號(hào)：090810）；喜樹堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100532－200401）。

2 方法與結(jié)果

2.1 響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)喜樹堿的提取工藝 利用Design－Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)，采用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇為提取溶劑，以提取溫度、提取時(shí)間、料液比3個(gè)因素為自變量，以喜樹果實(shí)粉末為材料，超聲提取為基本方法，喜樹堿的得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，包括析因?qū)嶒?yàn)和中心實(shí)驗(yàn)共17次，因素水平分析選取［7］，見表1。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and levels

2.2 喜樹堿含量測(cè)定 色譜條件：使用梯度流動(dòng)相（0～15min，25%乙腈線性升高到50%乙腈，梯度洗脫；15～18min，等度洗脫；18～19min，50%乙腈線性降至25%乙腈；19～20min，等度洗脫），流速1.0mL·min－1，柱溫為30℃，進(jìn)樣量10μL。

對(duì)照品溶液的制備：取喜樹堿對(duì)照品，精密稱定，采用甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為1mg·mL－1的儲(chǔ)備液，用時(shí)分別取0.5，1.0，2.0，4.0和8.0mL的儲(chǔ)備液，用甲醇定容10mL，搖勻，配成一系列不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：稱取2.0g喜樹果實(shí)粉末，裝入250mL錐形瓶中，按照表1的因素水平表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，提取液經(jīng)濾紙過濾，水浴揮干溶劑，用甲醇溶解、定容至10mL，0.22μm 微孔濾膜過濾，進(jìn)HPLC分析儀定量分析。

2.3 響應(yīng)曲面分析結(jié)果 按照表1進(jìn)行響應(yīng)曲面分析實(shí)驗(yàn)，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇超聲提取喜樹果實(shí)喜樹堿，響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表3。

對(duì)表2中的數(shù)據(jù)采用Design Expert軟件擬和得到提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）與喜樹堿得率之間的二次多項(xiàng)回歸方程：

喜樹堿得率（%）＝00.45＋1.850×10－3A ＋2.862×10－3B－7.125×10－4C－6.500×10－4AB－9.500×10－4AC－4.750×10－4BC－2.288×10－3A2－2.813×10－3B2－1.162×10－3C2

根據(jù)回歸方程做出的各因素的喜樹堿得率響應(yīng)面和等高線圖?？疾祉憫?yīng)面、等高線的形狀，分析提取溫度、提取時(shí)間和料液比對(duì)喜樹堿提取率的影響，結(jié)果見圖1～3，各因素及其相互作用對(duì)提取率的影響可以通過響應(yīng)面圖和等高線圖直觀反映出來(lái)，最佳工藝為：提取溫度49℃，提取時(shí)間2.5h，料液比1∶17。

從圖中可看出3種因素對(duì)喜樹堿提取率的影響，提取時(shí)間對(duì)提取率影響最顯著、溫度次之，表現(xiàn)為曲面較陡，料液比對(duì)喜樹堿提取率的影響較小，表現(xiàn)為曲面較緩。

表2 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of response surface analysis

表3 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Tab.3 Results of mathematic regression analysis

圖1 喜樹堿提取溫度、提取時(shí)間響應(yīng)曲面及等高線圖A.響應(yīng)曲面圖；B.等高線圖Fig.1 Response surface graph and contour line graph of extraction temperature and extraction time of CPTA.response surface graph；B.contour line graph

圖2 喜樹堿提取溫度、料液比響應(yīng)曲面及等高線圖A.響應(yīng)曲面圖；B.等高線圖Fig.2 Response surface graph and contour line graph of extraction temperature and solid－liquid ratio of CPTA.response surface graph；B.contour line graph

圖3 喜樹堿提取時(shí)間、料液比響應(yīng)曲面及等高線圖A.響應(yīng)曲面圖；B.等高線圖Fig.3 Response surface graph and contour line graph of extraction time and solid－liquid ratio of CPTA.response surface graph；B.contour line graph

較長(zhǎng)的提取時(shí)間和較高的提取溫度有利于喜樹堿的提取，但考慮到成本與成分的穩(wěn)定性，不能無(wú)限延長(zhǎng)提取時(shí)間和增加溫度。另外，可能由于喜樹堿的含量較低，喜樹堿含量不易達(dá)到飽和，提取料液比對(duì)喜樹堿提取率影響不顯著。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過Design Expert軟件計(jì)算并分析得到最優(yōu)條件：提取溫度49℃，提取時(shí)間2.5h，料液比1∶17，在此條件下提取喜樹果實(shí)喜樹堿，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，平均提取率為0.048 5%，與預(yù)測(cè)值0.05%接近。

3 討論

為考察各提取因素對(duì)喜樹堿提取率的影響，達(dá)到喜樹堿提取率最大化，本文選擇了喜樹堿含量最高的部位果實(shí)進(jìn)行了喜樹堿提取工藝優(yōu)選，以響應(yīng)曲面法來(lái)進(jìn)行參數(shù)的設(shè)計(jì)與擬合。響應(yīng)曲面法的原理是將選定影響因子與檢驗(yàn)?zāi)康闹笜?biāo)擬合，得到多元二次回歸函數(shù)，能夠通過響應(yīng)曲面圖和等高線圖研究影響因子與響應(yīng)值、因子與因子之間的相互關(guān)系，從而以較少的操作次數(shù)在短時(shí)間內(nèi)對(duì)所研究的工藝進(jìn)行優(yōu)選。本實(shí)驗(yàn)得到以喜樹堿為響應(yīng)面值的響應(yīng)面圖和等高圖，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，確定了最佳工藝，為實(shí)際生產(chǎn)及喜樹資源的充分利用提供參考。

［1］Wall M E，Wani M C，Cook C E，et al.Plant antitumor agents I.The isolation and structure of camptothecin，a novel alkaloidal leukemia and tumor inhibitor fromCamptotheca acuminata［J］.J Am Chem Soc，1966，88：3888－3890.

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［7］徐秀泉，于榮敏，劉柯，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化茅蒼術(shù)多糖的提取工藝［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（20）：12082－12085.