酶法提取苦豆草生物堿研究

李 軍，郝彩琴，陳海燕，郭鴻雁，冷曉紅（寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏中藥材開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，銀川 750021）

苦豆子（Sophora alopecuroides L.）又稱苦甘草、苦豆根，隸屬于豆科槐屬，為多年生草本、根莖地下芽植物，苦豆子藥材主要以全草、種子供藥用，習(xí)慣上將苦豆子花期的干燥地上部分作為“苦豆草”［1］；主產(chǎn)于寧夏、內(nèi)蒙古、山西、陜西、甘肅等地區(qū)［2］?？喽棺由飰A的藥理作用主要有鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)痛及降溫、抗心律失常、降血脂、抗病毒、抗炎及免疫抑制作用等［3－4］。臨床應(yīng)用的有克瀉靈片，治療菌痢、結(jié)腸炎和急慢性腸炎；苦參素注射液和苦參素膠囊，可治療慢性乙型病毒性肝炎等［5］。

目前，苦豆草中生物堿的提取方法種類繁多，要進(jìn)行工業(yè)化放大卻存在提取率偏低、設(shè)備昂貴、投資大、提取時(shí)間長等缺點(diǎn)，而酶法提取不需要更換和新增設(shè)備，只是在工藝上加以改進(jìn)就可提高生物堿的提取率［6－7］。為此，筆者在實(shí)驗(yàn)室酶法提取的基礎(chǔ)上，利用多功能提取濃縮機(jī)組對小試相關(guān)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化篩選，并對影響產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)成本的相關(guān)環(huán)節(jié)進(jìn)行考察，找到了一種方法可行、提取效果佳的小試提取工藝，為其進(jìn)一步的中試放大及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 DT－30動(dòng)態(tài)多功能提取濃縮機(jī)組（杭州春化自動(dòng)化研究所）；FQ－120往復(fù)式切藥機(jī)（山東青州精誠制藥設(shè)備有限公司）；TU－1810紫外分光光度計(jì)（北京普析通用分析儀器有限公司）；ACS－8電子天平（上海旺豐衡器有限公司）。

1.2 試藥 苦豆草（采于鹽池縣花馬池鎮(zhèn)德勝墩自然村等地），經(jīng)鑒定為豆科槐屬植物苦豆子（Sophora alopecuroides L.）的花期干燥地上部分，切段備用；纖維素酶（150 000U·g－1）購于寧夏和氏璧生物有限公司；濃鹽酸為國產(chǎn)化學(xué)純；其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法

2.1 苦豆草提取物含量測定 苦豆草總生物堿含20多種單體，其中以槐定堿的含量最高，參考相關(guān)文獻(xiàn)［8］，采用溴麝香草酚藍(lán)比色法以槐定堿為指標(biāo)成分測定苦豆草總生物堿含量（λ＝410nm）。具體方法如下：

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱定槐定堿對照品5.10mg，置于5mL量瓶中，加無水乙醇溶解定容即得槐定堿對照品溶液。取上述溶液0，20，40，60，80，100，120和140μL，分別置于50mL的磨口錐形瓶中，揮盡乙醇，加溴麝香草酚藍(lán)pH＝7.6緩沖液12mL、氯仿12mL，密塞劇烈振搖2min，靜置2h后分出氯仿層，以第一個(gè)為空白，于410nm處測定對照品溶液的吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)、氯仿層生物堿質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸，得回歸方程：A＝0.012 75C－0.005 71，r＝0.999 8。

2.1.2 樣品含量測定 分別吸取提取液1mL，稀釋至10mL，吸取0.2mL，置于錐形瓶中，加入溴麝香草酚藍(lán)pH 7.6緩沖液12mL、氯仿12mL，密塞振搖2min，靜置2h，分取氯仿層，以對應(yīng)的提取溶劑0.2mL、溴麝香草酚藍(lán)pH7.6緩沖液12mL和氯仿12mL同比操作為空白，于410nm處測定提取液的吸光度A，從制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得相應(yīng)的生物堿質(zhì)量濃度，并計(jì)算出苦豆草總生物堿的含量。

2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一批次提取的苦豆草提取物，按照2.1.2項(xiàng)下方法操作，平行測定5次吸光度值，計(jì)算RSD。

2.1.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批次提取的苦豆草提取物，按照2.1.2項(xiàng)下方法操作，每隔30min于410nm波長處測定吸光度，計(jì)算RSD。

2.1.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次提取的苦豆草提取物，按2.1.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按上述條件測定吸光度，計(jì)算RSD。

2.1.6 回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的苦豆草提取物0.25mL6份，分別加入1.02mg·mL－1對照品溶液25μL，按2.1.2項(xiàng)下方法制備和測定含量，計(jì)算回收率。

2.2 不同提取方法對生物堿提取率的影響 小試規(guī)模下，比較傳統(tǒng)提取和酶法提取苦豆草生物堿的提取率，具體步驟如下：前者是先稱取1kg經(jīng)粉碎的苦豆草段，加入4mL·L－1鹽酸（料液比1∶16），加熱至95℃回流提取4h，濾過，收集濾液，按2.1.2項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測定。后者是稱取1kg經(jīng)粉碎的苦豆草段，加水適量，同時(shí)加入纖維素酶（1∶1 000），加熱至50℃，保溫酶解4h，后加入鹽酸至濃度為4mL·L－1，料液比為1∶16，加熱至95℃回流提取4h，濾過，收集濾液按2.1.2項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測定。

2.3 酶法提取小試工藝條件的優(yōu)化 在實(shí)驗(yàn)室提取實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)優(yōu)化出苦豆草生物堿酶法提取的最適條件為：酶解時(shí)間4h，溶劑pH＝6，溫度為50℃，加酶量為1∶1 000，酶解后，加入鹽酸至濃度為4mL·L－1，料液比為1∶20，提取4h。苦豆草生物堿的提取率可達(dá)2.24%。在此工作的基礎(chǔ)上，本研究利用小試生產(chǎn)規(guī)模的提取罐進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在酶解參數(shù)不變的條件下，考察了提取次數(shù)、料液比、提取時(shí)間對提取率的影響，篩選出最優(yōu)的小試工藝條件。

3 結(jié)果與分析

3.1 苦豆草提取物含量測定方法學(xué)考察

3.1.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一批次提取的苦豆草提取物，按照2.1.2項(xiàng)下方法操作，平行測定5次吸光度值，5次測定結(jié)果的RSD為0.208%，說明儀器精密度良好。

3.1.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批次提取的苦豆草提取物，按照2.1.2項(xiàng)下方法操作，每隔30min于410nm波長處測定吸光度，RSD為1.42%，結(jié)果表明樣品溶液在120min內(nèi)測定穩(wěn)定。

3.1.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次提取的苦豆草提取物，按照2.1.2項(xiàng)下方法平行制備6份樣品溶液，按上述條件測定吸光度，6次測定結(jié)果的RSD為0.488%，說明方法重復(fù)性較好。

3.1.4 回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的苦豆草提取物0.25mL 6份，后各加入1.02mg·mL－1槐定堿對照品溶液25μL，按2.1.2項(xiàng)下方法制備和測定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果6次測定的回收率平均值為98.51%，RSD為1.99%，說明方法的準(zhǔn)確性較好。詳見表1。

表1 回收率測定結(jié)果Tab.1 The experiment results of recovery

3.2 小試提取工藝條件的優(yōu)化

3.2.1 不同提取方法對生物堿提取率的影響 通過比較苦豆草傳統(tǒng)提取和酶法提取2種方法，傳統(tǒng)提取法的提取率為1.46%，而酶法提取的提取率為1.76%，后者較大程度地提高了苦豆子生物堿的提取率，比煎煮提取法提高了26%。

3.2.2 不同提取次數(shù)對生物堿提取率的影響 通過對不同提取次數(shù)對苦豆草生物堿提取率的實(shí)驗(yàn)，第1次提取的提取率為1.58%，第2次提取的提取率為0.36%，第3次提取的提取率只有0.08%，表明經(jīng)過2次提取后，苦豆草中的生物堿已基本轉(zhuǎn)移到溶劑中，考慮綜合成本，以下實(shí)驗(yàn)選擇提取2次。

3.2.3 料液比對生物堿提取率的影響 對1∶10，1∶12和1∶16不同料液比進(jìn)行生物堿提取率的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，隨著料液比的增加，苦豆草生物堿的提取率在不斷增加，當(dāng)達(dá)到1∶16時(shí)，提取率最高達(dá)到2.08%。故以下實(shí)驗(yàn)選擇料液比1∶16。

3.2.4 不同提取時(shí)間對生物堿提取率的影響 在第1次提取生物堿時(shí)，生物堿的提取率在提取2h時(shí)已經(jīng)達(dá)到1.82%，而后隨著時(shí)間的延長基本沒有增加，反而呈下降趨勢，故第1次提取選擇提取2h。而第2次提取1h的生物堿提取率為0.35%，高于提取2h的。故第2次提取選1h。2次提取得出苦豆草生物堿的總提取率為2.17%。

4 討論

從植物中提取有效成分的首要條件是破壞細(xì)胞壁，使有效成分快速高效地進(jìn)入提取溶劑，而大多數(shù)植物的有效成分存在于細(xì)胞內(nèi)，因此提取的關(guān)鍵是如何有效地打破細(xì)胞壁這層壁壘［9］。而纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，亦是胞內(nèi)大分子溶出的主要屏障，纖維素酶可使纖維素降解為小分子物質(zhì)，利于胞內(nèi)成分溶出［10］，因此添加纖維素酶使苦豆草生物堿的提取率有了較大的提高，由原來的1.46%提高到了2.17%。

本研究在實(shí)驗(yàn)室酶法提取的基礎(chǔ)上進(jìn)行了小試生產(chǎn)條件優(yōu)化，按照實(shí)驗(yàn)室酶法提取條件放大后進(jìn)行小試，苦豆草生物堿的提取率僅為1.76%，與實(shí)驗(yàn)室酶法提取中提取率2.24%有一定差距，可能是由于熱量傳導(dǎo)、傳質(zhì)等實(shí)驗(yàn)條件的改變所致。故對小試生產(chǎn)中的料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，確定了小規(guī)模生產(chǎn)的工藝路線為：酶解時(shí)間4h，溶劑pH＝6，溫度為50℃，加酶量為1∶1 000，酶解后，加入鹽酸至濃度為4mL·L－1，料液比1∶16，提取2次，第1次2h，第2次1h。該工藝條件較實(shí)驗(yàn)室提取時(shí)，料液比由原來的1∶24改為1∶16，更符合工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際，酶解后酸提的時(shí)間由原來的4h縮短為3h，而提取率基本與實(shí)驗(yàn)室提取時(shí)接近［11］，提高了生產(chǎn)效率。

本研究開展的纖維素酶法提取小試工藝是藥品從研發(fā)到生產(chǎn)的必由之路，也是降低產(chǎn)業(yè)化實(shí)施風(fēng)險(xiǎn)的有效措施，是聯(lián)結(jié)中試放大和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的橋梁，可為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)積累必要的經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，具有重要意義。但其工藝參數(shù)需要在后續(xù)的中試工藝中進(jìn)行驗(yàn)證，可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行微調(diào)，最終確定具體可行的工藝參數(shù)［12］，為將其用于苦豆草生物堿的提取和后期的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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