雙黃痛風(fēng)膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

陳玉棠，黃藝蓉，成金樂，梁燕玲，陳金梅

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源科學(xué)與工程研究中心 嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006； 2.中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東 中山 528437)

雙黃痛風(fēng)膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

陳玉棠1，2，黃藝蓉1，2，成金樂2*，梁燕玲2，陳金梅2

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源科學(xué)與工程研究中心 嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006； 2.中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東 中山 528437)

目的補(bǔ)充優(yōu)化雙黃痛風(fēng)膠囊的薄層鑒別及含量測(cè)定方法，提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用薄層色譜法(TLC)對(duì)處方中赤芍、黃芪、秦皮進(jìn)行定性鑒別；用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(HPLC-ELSD)測(cè)定黃芪甲苷的含量。色譜條件：Agilent Zobax C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈-水(32∶68)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)。結(jié)果薄層鑒別方法專屬性強(qiáng)；HPLC法測(cè)得黃芪甲苷在1.123～6.741 μg(r=0.999 9)線性關(guān)系良好，平均回收率為99.75%，RSD=1.75%。結(jié)論提高后的標(biāo)準(zhǔn)方法簡(jiǎn)便可行，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可更好地控制雙黃痛風(fēng)膠囊的質(zhì)量。

雙黃痛風(fēng)膠囊；薄層色譜法；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法；黃芪甲苷；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

雙黃痛風(fēng)膠囊是正在研制開發(fā)的中藥第6類新藥，由黃芪、秦皮、赤芍、黃柏、茶葉組成，具有益氣活血、清熱利濕的功效，用于氣虛血瘀兼濕毒瘀阻型高尿酸血癥。黃芪甲苷為本方君藥黃芪的主要活性成分，具有抗心力衰竭、保護(hù)心血管、降壓、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)血液尿酸代謝等作用[1-2]。雙黃痛風(fēng)膠囊原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案中，鑒別項(xiàng)僅對(duì)茶葉所含的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)進(jìn)行薄層鑒別，未對(duì)處方中其他藥味進(jìn)行鑒別；含量測(cè)定項(xiàng)對(duì)黃芪甲苷的檢測(cè)采用操作繁雜、重復(fù)性較差的薄層色譜掃描法，結(jié)果準(zhǔn)確度不高。實(shí)驗(yàn)通過研究，在雙黃痛風(fēng)膠囊原標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，增加了對(duì)赤芍、黃芪和秦皮的薄層色譜鑒別，并改用HPLC方法對(duì)黃芪甲苷進(jìn)行含量測(cè)定，提高了雙黃痛風(fēng)膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1200RRLC快速液相色譜儀(G4218A的ELSD蒸發(fā)光檢測(cè)器)；Agilent Chemstation色譜工作站；AUW220D十萬分之一電子天平(島津公司)；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);KQ-400KOE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

黃芪甲苷(批號(hào)：110781-200613)、芍藥苷(批號(hào)：110736-201136)、秦皮甲素(批號(hào)：110740-200104)、秦皮乙素(批號(hào)：110741-200506)、黃芪對(duì)照藥材(批號(hào)：120974-201110)、赤芍對(duì)照藥材(批號(hào)：121093-200402)、秦皮對(duì)照藥材(批號(hào)：121415-200702),均購自中國食品藥品檢定研究院；雙黃痛風(fēng)膠囊(批號(hào)：110801，210301，310301)、陰性對(duì)照品由中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供；乙腈為色譜純；水為雙蒸水；其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 赤芍[3]

2.1.1.1 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物約3 g，置具塞錐形瓶中，加50%乙醇50 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解；用水飽和正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次20 mL，棄去氨液，取正丁醇液30 mL水浴蒸干(剩余30 mL，用于黃芪薄層鑒別供試品的制備)，殘?jiān)右掖? mL使溶解，即可。

2.1.1.2 對(duì)照品溶液的制備 另取芍藥苷對(duì)照品適量，加乙醇制成2 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.1.1.3 對(duì)照藥材溶液的制備 取赤芍對(duì)照藥材0.5 g，加乙醇10 mL，振搖5 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，即可。

2.1.1.4 陰性樣品溶液的制備 取不含赤芍的陰性樣品，按“供試品溶液制備方法”制成陰性樣品溶液。

2.1.1.5 TLC鑒別 按照薄層色譜法[4]，吸取上述4種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干。噴以5%香草醛硫酸溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾，見圖1。

1.芍藥苷對(duì)照品 2.赤芍對(duì)照藥材 3.缺赤芍陰性樣品 4～6.供試品(批號(hào)：110801，210301，310301)圖1 雙黃痛風(fēng)膠囊中赤芍TLC圖

2.1.2 黃芪[4，5]

2.1.2.1 供試品溶液的制備 取2.1.1赤芍供試品溶液制備項(xiàng)下剩余的30 mL正丁醇液，蒸干；殘?jiān)铀? mL微熱使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為12 cm)依次以50 mL水、30 mL40%乙醇、50 mL 70%乙醇洗脫，收集70%乙醇的洗脫液，蒸干；用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即可。

2.1.2.2對(duì)照品溶液的制備 取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇制得1 mg·mL-1的黃芪甲苷對(duì)照品溶液，置于4 ℃保存。

2.1.2.3 對(duì)照藥材溶液的制備 取黃芪對(duì)照藥材1 g，加甲醇20 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液加于中性氧化鋁柱(100～120目，5 g，內(nèi)徑10～15 mm)上，用40%甲醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干；殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液；用水萃取2次，每次20 mL；棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即可。

2.1.2.4 陰性樣品溶液 取不含黃芪的陰性樣品，按2.1.2.1項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。

2.1.2.5 TLC鑒別 按照薄層色譜法[4]，吸取上述4種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶2)10 ℃以下放置過夜的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。

1.黃芪甲苷對(duì)照品 2.黃芪對(duì)照藥材；3.缺黃芪陰性樣品 4～6.供試品(批號(hào)：110801，210301，310301)圖2 雙黃痛風(fēng)膠囊中黃芪TLC圖

2.1.3 秦皮

2.1.3.1供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物約3 g，置具塞錐形瓶中，加乙醇40 mL，加熱回流2次，每次30 min，濾過，濾液濃縮至稠膏，加水20 mL溶解，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 mL，取乙酸乙酯層，濃縮至稠膏。濃縮液加乙醇5 mL溶解，加到聚酰胺柱(內(nèi)徑10～15 mm，柱高15 cm)，水洗脫至無顏色，蒸干。用乙醇溶解定容到2 mL量瓶中。

2.1.3.2 對(duì)照品溶液制備 取秦皮甲素對(duì)照品和秦皮乙素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL各含2 mg的混合溶液。

2.1.3.3 對(duì)照藥材溶液的制備 取秦皮對(duì)照藥材1 g，加甲醇10 mL，加熱回流10 min，放冷，濾過，取濾液。

2.1.3.4 陰性樣品溶液制備 取不含秦皮的陰性樣品，按2.1.3.1項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備。

2.1.3.5 TLC鑒別 按照薄層色譜法[4](《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述8種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(10∶2.5∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，在365 nm下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照樣品無干擾。

1.秦皮甲素對(duì)照品 2.秦皮乙素對(duì)照品 3.混合對(duì)照品 4.缺秦皮陰性樣品 5.秦皮對(duì)照藥材 6～8.供試品(批號(hào)：110801，210301，310301)圖3 雙黃痛風(fēng)膠囊中秦皮TLC圖

2.2 黃芪甲苷的含量測(cè)定[6-9]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zobax C18(250 mm×4.6mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(32∶68)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；ELSD蒸發(fā)光散射檢測(cè)器參數(shù)：漂移管溫度40 ℃，載氣(氮?dú)?壓力3.5 Bar。理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算不低于4 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成0.1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下本品內(nèi)容物研細(xì)，取約0.75 g，精密稱定，精密移取80%甲醇50 mL于具塞錐形瓶中，稱定；超聲處理45 min(功率320 W，頻率4 kHz)，放冷，用甲醇補(bǔ)足損失量，濾過，濾液蒸干。殘?jiān)铀?5 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液；用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液；正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 取缺黃芪的陰性對(duì)照樣品，照2.2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備制成陰性樣品溶液。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 精密吸取上述3種溶液各20 μL，分別注入色譜儀，按其色譜條件測(cè)定，結(jié)果見圖3。供試品溶液和對(duì)照品溶液在相應(yīng)保留時(shí)間出現(xiàn)相似峰，分離度良好，而陰性樣品溶液在黃芪甲苷色譜峰相應(yīng)的保留時(shí)間處無干擾，黃芪甲苷峰與其他組分達(dá)到基線分離。

A.黃芪甲苷對(duì)照品 B.供試品 C.缺黃芪陰性樣品圖3 雙黃痛風(fēng)膠囊及對(duì)照品HPLC圖

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密移取黃芪甲苷對(duì)照品溶液(0.5 mg·mL-1)0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，分別吸取續(xù)濾液20 μL注入液相色譜儀測(cè)定，以進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=1.611 3X+5.094 5，r=0.999 9。黃芪甲苷在1.123～6.741 μg與峰面積對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)得黃芪甲苷峰面積對(duì)數(shù)的RSD=0.01%，說明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，室溫下放置，分別在0，2，4，6，8，10，24 h依法測(cè)定，得黃芪甲苷峰面積對(duì)數(shù)的RSD=0.13%(n=7)，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取同一批樣品(批號(hào)：310301)5份，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，依法測(cè)定，結(jié)果黃芪甲苷含量的RSD=0.03%，表明方法重現(xiàn)性好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批樣品(批號(hào)：310301)6份，每份約1 g，分別精密加入黃芪甲苷對(duì)照品溶液(即0.5 mg·mL-1)0.8，0.9，1.0 mL，按2.2.3項(xiàng)下方法配制供試品溶液，依法測(cè)定，進(jìn)樣量為20 μL，記錄色譜峰，計(jì)算回收率及其RSD值，見表1。

表1 雙黃痛風(fēng)膠囊中黃芪甲苷加樣回收率試驗(yàn)

2.2.11 樣品含量測(cè)定 分別取不同批號(hào)樣品，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批取3份，依法測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 雙黃痛風(fēng)膠囊中黃芪甲苷含量測(cè)定

2.2.12 最低檢測(cè)限試驗(yàn) 精密移取黃芪甲苷對(duì)照品溶液(1.123 mg·mL-1)1 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，再精密量取3 μL，注入高效液相色譜儀，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，采用信噪比法，測(cè)得色譜圖中信噪比為3.2，因此黃芪甲苷的檢測(cè)限為168 ng。

3 討論

在赤芍的薄層鑒別中，本法制備的供試品溶液，所得的薄層色譜背景雜質(zhì)干擾小，斑點(diǎn)清晰。同時(shí)，該供試品溶液制備方法亦用作黃芪薄層鑒別項(xiàng)供試品前處理的制備，可大大簡(jiǎn)化操作步驟，提高實(shí)驗(yàn)效率。本實(shí)驗(yàn)也考察了乙酸乙酯-冰醋酸-水(8∶2∶1)[10]、三氯甲烷-甲醇(5∶1)[11]等不同的展開劑系統(tǒng)，但展開效果不佳，而本文采用的展開系統(tǒng)分離效果好、斑點(diǎn)清晰。

秦皮的薄層鑒別中，曾參考《中國藥典》2010年版秦皮藥材的供試品制備方法，但受到其他物質(zhì)的嚴(yán)重干擾，無法顯現(xiàn)斑點(diǎn)，經(jīng)過摸索，本實(shí)驗(yàn)的方法經(jīng)提取純化后能排除雜質(zhì)的干擾，更適合本制劑的薄層鑒別。同時(shí)也考察不同展開系統(tǒng)，結(jié)果存在陰性干擾或與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，未顯相同顏色的斑點(diǎn)。本展開系統(tǒng)是根據(jù)《中國藥典》方法通過調(diào)整得出的，斑點(diǎn)分離得好，不受雜質(zhì)干擾。

在黃芪甲苷的含量測(cè)定項(xiàng)中，供試品溶液的制備分別考察了不同提取方法(索氏提取和超聲提取方法)、不同提取溶劑(水、50%甲醇、80%甲醇、2%氫氧化鉀甲醇溶液)對(duì)黃芪甲苷含量的影響，結(jié)果表明以80%甲醇作溶媒超聲提取效果最佳，而2%氫氧化鉀甲醇溶液提取黃芪甲苷含量雖高，但長(zhǎng)時(shí)間處在堿性條件下，可能會(huì)導(dǎo)致成分發(fā)生變化，故不選用。本實(shí)驗(yàn)還考察了不同提取時(shí)間(30，45，60 min)和不同純化方法(過大孔樹脂柱和不過樹脂柱)對(duì)黃芪甲苷含量影響，結(jié)果超聲45 min和不過大孔樹脂柱方法的效果為佳。

實(shí)驗(yàn)選用ELSD檢測(cè)器，能克服DAD檢測(cè)器對(duì)皂苷類成分紫外末端吸收弱的缺點(diǎn)，更好地用于皂苷類成分的檢測(cè)。

[1] 韓洪.防己黃芪湯加減治療慢性尿酸性腎病[J].北京中醫(yī)，2004，23(3)：155.

[2] 肖艷，文旺秀，程康林，等.中醫(yī)藥對(duì)高血壓病血尿酸代謝影響的臨床觀察[J].天津中醫(yī)，2002，19(1)：17.

[3] 于密密，傅欣彤.小敗毒膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(23)：79-82.

[4] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄34.

[5] 朱麗萍，安叡，王新宏.糖泰片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35(3)：66-69.

[6] 李曉蒙，李曉瑩，徐位良，等.糖康安顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，18(3)：169-171.

[7] 鄧少榮，曾建武，李靖，等.促孕合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(23)：64-66.

[8] 張彤，黃順旺.HPLC-ELSD測(cè)定前列舒樂顆粒中的黃芪甲苷[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(7)：82-83.

[9] 肖佳尚，朱濤.HPLC-ELSD法測(cè)定芪紅膠囊中黃芪甲苷的含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，23(2)：138-140.

[10] 王欣美.蠶蟲草和復(fù)方中藥陰道泡騰片的質(zhì)量研究[D].上海：復(fù)旦大學(xué)，2003.

[11] 趙珺.舒肝和胃降逆顆粒提取工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[D].蘭州：蘭州大學(xué)，2009.

StudiesonImprovingQualityStandardofShuanghuangTongfengCapsules

CHENYutang1，2，HUANGYirong1，2，CHENGJinle2*，LIANGYanling2，CHENJinmei2

(1.ResearchCenterofChineseHerbalResourceScienceandEngineering，GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine，KeyLaboratoryofChineseMedicinalResourcefromLingnan(GuangzhouUniversityofChineseMedicine)，MinistryofEducation，Guangzhou510006，China； 2.ZhongshanZeusPharmaceuticalGroupCo.，Ltd.，Zhongshan528437，China))

Objective：To impove the quality standard of Shuanghuang Tongfeng Capsules.MethodsThe TLC method was used to identifyPaenoiaeRadixRubra，AstragaliRadixandFraxiniCortex.The study of HPLC-ELSD methodology was carried out to determine the content of Astragaloside Ⅳ in the capsules.Chromatography method was performed on an Agilent Zobax ODS column(250 mm×4.6 mm，5 μm)，the mobile phase composition was acetonitrile-water(32∶68).ResultsThis method is good in separation，strong in specificity.The linear range of Astrogaloside Ⅳ was 1.123-6.741 μg(r=0.999 9).The average recovery rate was 99.75%，RSD1.75%.ConclusionThe method is simple，feasible and reproducible.It can be used for the quality control of Shuanghuang Tongfeng Capsules.

Shuanghuang Tongfeng Capsules；TLC；HPLC-ELSD；Astrogaloside Ⅳ；Quality

*

成金樂，主任中藥師，研究方向：創(chuàng)新中藥開發(fā)；Tel：(0760)85312928，E-mail：gdcjl9@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.03.015

2013-09-12)

standard