酸性染料比色法測定不同種質(zhì)檳榔總生物堿的含量△

楊新全，何明軍，盧麗蘭*，侯明

(1.中國醫(yī)學科學院 藥用植物研究所 海南分所，海南 萬寧 571533； 2.海南省南藥資源保護與開發(fā)重點實驗室，海南 萬寧 571533)

酸性染料比色法測定不同種質(zhì)檳榔總生物堿的含量△

楊新全1，2，何明軍1，2，盧麗蘭1，2*，侯明1，2

(1.中國醫(yī)學科學院 藥用植物研究所 海南分所，海南 萬寧 571533； 2.海南省南藥資源保護與開發(fā)重點實驗室，海南 萬寧 571533)

目的建立一種簡便且準確測定檳榔中總生物堿含量的方法。方法以氫溴酸檳榔堿為對照品，采用酸性染料比色法測定總生物堿的含量，測定波長為618 nm。結(jié)果檳榔總生物堿在20～120 μg呈線性關系，回歸方程為Y=4.226 7X-0.005 2(r=0.999 6)，平均回收率為99.6%，RSD=1.54%。穩(wěn)定性、精密度和重復性都比較高，RSD分別為1.32%，0.109%，2.18%。樣品分析結(jié)果為紅心檳榔含量最高，常見檳榔含量次之，西瓜檳榔較低。結(jié)論該方法操作簡便、靈敏、準確，可用于檳榔總生物堿的質(zhì)量控制。

酸性染料比色法；檳榔；總生物堿

檳榔是棕櫚科植物檳榔ArecacatechuL.的干燥成熟種子，原產(chǎn)于馬來西亞，在我國主產(chǎn)于海南、臺灣、云南河口及西雙版納熱帶雨林間，廣西、廣東及福建僅有少量分布[1]。檳榔作為我國著名四大南藥之首，是一種常用中藥，其主要成分是生物堿。據(jù)目前分析測定，檳榔含生物堿0.3%～0.6%，主要為檳榔堿，含量為0.1%～0.5%；其余為檳榔次堿、去甲基檳榔次堿、去甲基檳榔堿、檳榔副堿和高檳榔堿等，它們均與鞣酸結(jié)合而存在[2]。由于生物堿呈一定程度的堿性，所以檳榔堿在植物體組織和器官中常與酸性物質(zhì)結(jié)合成鹽存在，而真正呈游離狀態(tài)的檳榔堿極其少。

檳榔具有殺蟲，消積，行氣，利水，截瘧功能[5]，可作強壯劑、消化劑、收斂劑、抗虐劑、消腫劑、鎮(zhèn)咳劑和痛經(jīng)劑，也與其他藥物配成利尿和治療腹瀉、食滯、脘腹脹痛、水腫、腰痛、高山熱、支氣管炎的藥丸，也是防治蛔蟲、姜片蟲及家畜胃寄生蟲的特效藥[3-4]。關于檳榔中生物堿的測定方法，有滴定法[5-6]、薄層掃描法[7]、陽離子交換色譜法[8]和反相高效液相色譜法[9-10]等，這些方法或操作繁瑣，或?qū)x器要求較高。生物堿鹽與酸性染料形成離子對，可被三氯甲烷定量提取，加入堿液后酸性染料游離出來，因此用比色法測定該有色溶液的吸光度，從而確定生物堿的含量[11]。筆者采用酸性染料比色法對海南

常見檳榔、西瓜檳榔(檳榔果表皮具斑狀花紋得名)、紅心檳榔(檳榔果果仁中心紅色得名)等3種不同檳榔的檳榔堿含量進行對比，期望對我國現(xiàn)有不同種質(zhì)檳榔中檳榔堿的含量差異有比較清楚的認識，從而為檳榔的標準化種植和生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與儀器

UV-2450分光光度計(日本島津公司)，雷磁pH-25酸度計(上海精宏實驗設備有限公司)，KQ-500D數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，AL104-1C萬分之一電子天平(托利多上海有限公司)，DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)。

氫溴酸檳榔堿(廣州市藥品檢驗所，批號：300-08-3，經(jīng)GC測定含量達98.5%)；0.8 mg·mL-1的溴甲酚綠溶液、0.01 mol·L-1的氫氧化鉀無水乙醇溶液均為分析純，檳榔藥材采自于海南萬寧、瓊中、陵水地區(qū)，供試樣品為常見檳榔、西瓜檳榔、紅心檳榔，性狀見表1。

表1 3種檳榔樣品性狀

注：不同小寫字母代表不同種質(zhì)檳榔果實的差異程度(P<0.05)

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取氫溴酸檳榔堿125 mg，置50 mL容量瓶中，加pH=5.0 醋酸-醋酸鈉緩沖液溶液(由0.1 mol·L-1的醋酸鈉和0.1 mol·L-1的醋酸配制而成)并稀釋至刻度，得對照品貯備液。精密吸取1 mL貯備液置50 mL容量瓶中，加上述緩沖液稀釋至刻度，得對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取檳榔粉末(事先用萬能粉碎機粉碎后過3號篩而得)約1.000 0 g，置帶塞磨口錐形瓶中，精密加入濃氨水6 mL浸潤2 min，加乙醚30 mL超聲振蕩20 min，分取乙醚液，殘渣加乙醚超聲振蕩3次，每次10 mL，各5 min，合并乙醚液，最后加入適量乙醚洗滌錐形瓶2～3次(上述實驗經(jīng)驗證需要進行過濾操作)。50 ℃水浴蒸發(fā)至約10 mL，移置分液漏斗中，用0.01 mol·L-1硫酸溶液40 mL，分4次萃取，每次分別為15，10，10，5 mL。萃取酸水液同置50 mL容量瓶中，用1 mol·L-1醋酸鈉調(diào)至 pH=5，搖勻，用pH=5.0 醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋至刻度，即得供試品溶液。

2.3 標準曲線的繪制

精密吸取對照品溶液0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4 mL，分別置分液漏斗中，于618 nm波長處測定吸光度，以檳榔堿量為橫坐標(X)，以吸光度為縱坐標(Y)作標準曲線，得回歸方程：Y=4.226 7X-0.005 2(r=0.999 6)，表明檳榔堿在20～120 μg具有良好的線性關系。

2.4 穩(wěn)定性試驗

精密吸取常見檳榔供試品溶液1 mL，于618 nm波長處每隔10 min測定其吸光度，結(jié)果表明自測定起1 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD=1.32%。1 h后吸光度有所下降，所以一定要控制測定濃度的時間。

2.5 精密度試驗

取氫溴酸檳榔堿對照品溶液，連續(xù)測定6次，吸光度的RSD=0.11%，表明儀器精密度符合要求。

2.6 重復性試驗

精密稱取常見檳榔粉末6份，各約1.000 0 g，置帶塞磨口錐形瓶中，同樣品制備和測定方法項條件下操作，結(jié)果平均含量為0.502 mg·g-1，RSD=2.18%，表明樣品制備和測定誤差符合要求。

2.7 回收率試驗

精密稱取常見檳榔粉末6份，各約1.000 0 g，精密加入對照品溶液0.5 mL，同供試品制備項下操作，于618 nm處測吸光度，結(jié)果如表2所示。

表2 檳榔樣品中氫溴酸檳榔堿回收率試驗

注：氫溴酸檳榔堿對照品加入量均為0.120 mg

2.8 不同種質(zhì)檳榔果實總生物堿含量測定

精密吸取供試品溶液1 mL置分液漏斗中，精密加入pH=5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液4 mL和溴甲酚綠溶液2 mL，輕輕搖勻。分3次萃取，分別精密加入三氯甲烷2，3，5 mL，每次振搖2 min，靜置30 min，分取三氯甲烷層，置預先放有無水硫酸鈉0.2 g的干燥容量瓶中，振搖，靜置30 min，精密吸取上清液 5 mL，精密加入0.01 mol·L-1的氫氧化鉀無水乙醇液1 mL，搖勻后于618 nm波長處測定吸光度。3種檳榔中總生物堿的含量測定結(jié)果見表3。紅心檳榔總生物堿含量最高，常見檳榔含量次之，西瓜檳榔較低。

表3 不同種質(zhì)檳榔果實中總生物堿的含量測定

注：小寫字母a表示不同種質(zhì)檳榔果實的總生物堿含量差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)

3 討論

在測定最大吸收波長時，用三氯甲烷萃取液直接測定，結(jié)果在414 nm波長處離子對有最大吸收，加入0.01 mol·L-1的氫氧化鉀無水乙醇溶液所游離染料在618 nm波長處有最大吸收，而且其靈敏度比前者增加1倍，空白吸收也較前者小[8]。經(jīng)驗證后，確實如上所述，故采用后者。

由于三氯甲烷中水分含有微量的酸性染料，影響測定結(jié)果的準確性，為了消除其影響，可采用離子對提取后靜置30 min，再用無水硫酸鈉脫水的方法[11]。

實驗方法操作簡便、靈敏、準確，可用于檳榔中生物堿的含量測定。3種不同種質(zhì)檳榔果實中總生物堿分析結(jié)果表明，紅心檳榔含量最高，常見檳榔含量次之，西瓜檳榔較低。不同種質(zhì)檳榔總生物堿的差異可能受到種植環(huán)境、氣候等外在因素的影響，也可能來自種質(zhì)遺傳基因的內(nèi)在因素影響。因此，從用藥考慮，在今后檳榔種植中，建議優(yōu)先考慮紅心檳榔。

[1] 南京藥學院藥材教研組.藥材學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1994：1041-1045.

[2] 胡四琴，徐仿舟，高文平，等.檳榔生物堿提取分離及檢測方法的研究進展[J].中藥材， 2009，32(2)：308-311.

[3] 杜道林，王小英，甘炳春，等.不同品種檳榔果實性狀及其檳榔堿含量的比較研究[J].廣西植物，2004，24(5)：433.

[4] 梁寧霞.檳榔藥理作用研究進展[J].江蘇中醫(yī)藥，2008，25(8)：55-56.

[5] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：342-343.

[6] 黃永華.檳榔有效化學成分分析測定[J].食品與機械，2002，(3)：38-39.

[7] 林勵，呂武清.檳榔中檳榔堿含量的薄層掃描測定[J].中國中藥雜志，1992，17(8)：491-494.

[8] 陳浩桉，賴宇紅，王曉鈺，等.高效陽離子交換色譜法測定檳榔中檳榔堿的含量[J].中藥材，2002，25 (1)：27-28.

[9] 文開齊.高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法測定檳榔食品中檳榔堿的含量[J].中國實用醫(yī)藥，2008，3(8)：12-13.

[10] 楊春，蘇少忠，陳杏云，等.RP-HPLC法測定胃痛顆粒中檳榔堿的含量[J].中國中藥雜志，2003，28 (5)：459-460.

[11] 徐潔.酸性染料比色法測定檳榔中總生物堿的含量[J].海峽藥學，2001，13 (1)：30-31.

DeterminationofTotalAlkaloidsfromDifferentArecanut(ArecacatechuLinn)GermplasmbyAcidDyeColorimetryMethod

YANG Xinquan1，2，HE Mingjun1，2，LU Lilan1，2*，HOU Ming1，2

(1.HainanBranch，InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences，Wanning571533，China； 2.HainanProvincialKeyLaboratoryofResourcesConservationandDevelopmentofSouthernMedicine，Wanning571533，China)

Objective：To establish a simple and accurate method for the determination of total alkaloids in arecanut.MethodsThe determination was carried out by acid dye colorimetry with arecoline hydrobromide as reference，at wavelength of 618 nm on UV-2450 spectrophotometer.ResultsThe total alkaloid contents of arecanut were linear in the range of 20 to 120 μg，the regression equation wasY=4.226 7X-0.005 2 (r=0.999 6)，the average recovery was 99.6% with a RSD of 1.54%.There was a relatively high stability，precision and repeatability，RSD were 1.32%，0.109% and 2.18% respectively.The results of sample analysis showed the highest total alkaloid content was in red arecanut germplasm，followed by common arecanut germplasm，the lowest in watermelon arecanut germplasm.ConclusionThe method is simple，sensitive and accurate.

Acid dye colorimetry；ArecacatechuLinn；Total alkaloids

國家科技支撐計劃——重點道地南藥良種選育及規(guī)范化生產(chǎn)關鍵技術(shù)研究(2007BAI27B03)；國家科技支撐計劃——白木香等7種中藥材規(guī)范化種植基地及其SOP優(yōu)化升級研究(2011BAI01B07)

*

盧麗蘭，博士，助理研究員，研究方向：土壤理化、植物營養(yǎng)；Email：lulilan1234@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.03.006

2013-06-25)