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    一測多評法測定黃柏中5種生物堿

    2014-11-01 03:18:12吳珊珊胡昌江呂非非李文兵
    中成藥 2014年1期
    關(guān)鍵詞:木蘭花巴馬小檗

    吳珊珊,胡昌江,呂非非,高 源,李文兵

    (成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,四川成都 611137)

    黃柏為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮,具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效[1],為臨床常用藥物。其主要成分有小檗堿、黃柏堿、木蘭花堿、巴馬汀、藥根堿等生物堿類,其中含有量最高的為小檗堿[2-4]?,F(xiàn)代藥理研究表明,鹽酸小檗堿具有抗炎,降血壓,降血糖和免疫調(diào)節(jié)等作用,黃柏堿與降壓作用有關(guān),而巴馬汀、藥根堿為抗病原微生物的有效成分[5-6]。2010年版《中國藥典》以小檗堿和黃柏堿的量作為黃柏質(zhì)量控制指標(biāo),尚不能全面反應(yīng)黃柏的質(zhì)量。目前,雖有文獻(xiàn)報道,采用HPLC法同時測定黃柏中多種生物堿的量[7-8],但需要多種對照品,限制了實際工作中的應(yīng)用。

    本實驗以小檗堿為參照物,得出黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀與小檗堿之間的相對校正因子(F),同時測定了黃柏中木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿的量,建立一測多評法(QAMS)[9-17],從而降低檢測成本和時間,提高方法的實用性。

    1 儀器與試藥

    Agilent 1200高效液相系統(tǒng),Shimadzu LC-20AT高效液相系統(tǒng),F(xiàn)E20梅特勒-托利多pH計,Sartorius BP211D電子分析天平,KQ-300E超聲儀(40 kW),乙腈、甲醇為色譜純,水為超純水,其余試劑均為分析純。

    木蘭花堿(Must-12022901)、鹽酸黃柏堿(Must-12021407)、鹽酸藥根堿(Must-10122001)、鹽酸巴馬汀(Must-11122703)和鹽酸小檗堿(Must-111212110)均購自成都曼斯特生物科技有限公司,純度為98%。黃柏樣品1~3號購自廣西,4~7號購自貴陽,8~9號購自湖北,10號購自湖南,11~30號購自四川滎經(jīng)、青城山、都江堰、彭州、瀘州等地藥材市場和不同的飲片公司。經(jīng)本校生藥室教研室盧先明教授鑒定為黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮。

    2 分析方法與結(jié)果

    2.1 一測多評方法學(xué)考察

    2.1.1 色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm),Thermo C18(4.6 mm×250 mm,5μm),Diamonsil C18(2)(4.6 mm×250 mm,5μm)。柱溫 30 ℃,體積流量1mL/min,檢測波長280 nm,流動相A為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(KH2PO4)(45∶55)(每100 mL中加入0.4 g十二烷基硫酸鈉,調(diào)節(jié)pH至4.8),流動相 B為乙腈-0.05 mol/L KH2PO4(55∶45)(每100 mL中加入0.4 g十二烷基硫酸鈉,調(diào)節(jié)pH至4.5),梯度洗脫,0~12 min(0 B),12~18 min(0~100%B),18~40 min(100%B),40~42 min(100% ~0 B),42~48 min(0 B)。上述色譜條件下,各組分分離度良好,色譜圖見圖1。

    圖1 混合對照品(A)和樣品(B)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and samples(B)

    2.1.2 對照品溶液的制備 取木蘭花堿、鹽酸黃柏堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿5種生物堿,精密稱定 10.24、9.8、9.09、10.92、14.42 mg,分別置于10 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度。再稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度。精密移取稀釋后的5個對照品溶液適量配為混合對照品溶液。將上述溶液保存于4℃冰箱中備用。

    2.1.3 供試品溶液的制備 取黃柏藥材粉末(過4號篩)約0.5 g,精密稱定,置于100 mL錐形瓶,精密加入鹽酸-甲醇(1∶100)的混合液40 mL,稱定質(zhì)量,超聲30 min,冷卻后加鹽酸-甲醇(1∶100)的混合液補(bǔ)足失質(zhì)量,過濾,取續(xù)濾液過0.45μm 濾膜,5μL 進(jìn)樣。

    2.1.4 線性范圍考察 精密吸取上述混合對照品溶液40、20、10、8、6、4、2、1μL,進(jìn)樣分析,每個質(zhì)量濃度進(jìn)樣3次,取平均值。以進(jìn)樣量對峰面積積分值進(jìn)行回歸處理,得小檗堿、木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1。

    表1 黃柏中5種生物堿類成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab.1 Standard curves of five alkaloids

    2.1.5 校正因子計算 以小檗堿為內(nèi)標(biāo),計算小檗堿對木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀的校正因子,見表2。

    表2 黃柏生物堿相對校正因子Tab.2 Relative correction factors(RCF)of alkaloids

    2.1.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液5μL于同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次,記錄木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿的峰面積,得出日內(nèi)精密度分別為 0.68%、0.74%、1.30%、0.93%和0.81%。表明儀器較為穩(wěn)定。

    2.1.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液5μL分別于配制后的0、2、4、8、12、24、48 h測定峰面積,計算得木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿穩(wěn)定性的 RSD分別為0.66%、0.34%、0.38%、0.11%和0.63%。表明供試品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.1.8 重復(fù)性試驗 稱取黃柏藥材粉末(過4號篩)約0.5 g共6份,精密稱定,按“2.1.3”項下制備樣品,測定,木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿的 RSD分別為1.9%、2.5%、1.3%、1.2%和2.2%。表明該方法重復(fù)性好。

    2.1.9 加樣回收率試驗 精密稱取0.5 g湖北產(chǎn)黃柏藥材粉末(小檗堿含有量3.81%)6份,加鹽酸-甲醇(1∶100)的混合液40 mL,稱定質(zhì)量,超聲30 min,冷卻后加鹽酸-甲醇(1∶100)的混合液補(bǔ)足失質(zhì)量,過濾,取濾液2 mL,加1 mL鹽酸小檗堿(1.007 mg/mL)定容到10 mL,再次超聲30 min(重現(xiàn)提取過程),0.45μm濾膜過濾,進(jìn)樣,測定,計算,得加樣回收率分別為97.1%、98.8%、 96.9%、 100.9%、 99.0%、 95.6%、RSD為1.9%。

    2.2 校正因子的重現(xiàn)性考察

    2.2.1 色譜柱及高效液相色譜儀考察 取“2.1.2”項下混合對照品溶液,進(jìn)樣20、10、8、6、4、2μL,按“2.1.5”項下計算小檗堿對木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀的校正因子。不同高效液相色譜系統(tǒng)和不同品牌柱子的相對校正因子見表3。

    2.2.2 待測組分色譜峰的定位 利用5個成分色譜行為的不同,以小檗堿為基準(zhǔn)峰計算各個化合物的相對保留時間,即確定其在色譜圖中的位置。結(jié)果見表4。

    表3 不同儀器和色譜柱測得相對校正因子Tab.3 RCFs determined by different instruments and columns

    表4 不同儀器和色譜柱測得相對保留值Tab.4 Relative retention time(RTR)determined by different instruments and columns

    2.3 一測多評法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定結(jié)果的比較按供試品溶液處理方法制備樣品,分別精密吸取供試品溶液各5μL注入高效液相色譜儀測定。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和一測多評法分別計算黃柏中木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿的量,結(jié)果見表5。

    測定結(jié)果表明,同一樣品中木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿的量差異較大,小檗堿的量最高,部分地區(qū)不含或含少量藥根堿和巴馬汀。同時,不同產(chǎn)地黃柏生物堿量差異比較大,川產(chǎn)黃柏小檗堿和黃柏堿量較其他產(chǎn)區(qū)高,其中以四川滎經(jīng)產(chǎn)黃柏含有量最高。

    3 討論

    實驗過程中,考察了鹽酸-甲醇(1∶100)、乙酸-甲醇(1∶100)、60%乙醇和甲醇4種不同提取溶劑,采用超聲提取30 min,權(quán)衡5種成分提取效率,結(jié)果以鹽酸-甲醇(1∶100)作為溶劑提取較為完全。同時,考察了乙腈-磷酸鹽溶液作為流動相系統(tǒng)進(jìn)行分析,其峰型較差,色譜峰重疊,改為乙腈-磷酸二氫鉀(十二烷基硫酸鈉,磷酸調(diào)節(jié)pH)后,峰型改善,但木蘭花堿和黃柏堿色譜峰重疊,無法得到有效分離。因為將木蘭花堿與黃柏堿、巴馬汀與小檗堿同時有效分離需要不同濃度的有機(jī)相和不同pH。因此,考察不同pH不同乙腈濃度的混合流動相作為洗脫劑,最后實驗確定以乙腈-0.05 mol/L KH2PO4(45∶55)(每100 mL中加入0.4 g十二烷基硫酸鈉,調(diào)節(jié)pH至4.8)為流動相A,乙腈-0.05 mol/L KH2PO4(55∶45)(每100 mL中加入0.4 g十二烷基硫酸鈉,調(diào)節(jié)pH至4.5)為流動相B,作為流動相,使各成分完全分離,且峰形較好。

    表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線法和一測多評法測定黃柏中生物堿的比較Tab.5 Contents of alkaloids by external standard method and QAMS

    本實驗考察了不同色譜柱、液相色譜系統(tǒng)對小檗堿與木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿和巴馬汀之間相對校正因子的影響,驗證一測多評法在黃柏質(zhì)量控制中的可行性和技術(shù)適應(yīng)性。標(biāo)準(zhǔn)曲線法和一測多評法測定30批黃柏中生物堿的結(jié)果表明,一測多評法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法得到的數(shù)值之間沒有顯著性差異,說明建立的校正因子具有較好的可信度,一測多評法能同時測定黃柏中小檗堿、木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿和巴馬汀的量。

    實驗中,通過對5個成分的吸收光譜并結(jié)合3D圖進(jìn)行分析,選擇280 nm作為檢測波長,5個生物堿都有吸收。黃柏堿及木蘭花堿與另3個生物堿母核結(jié)構(gòu)不同(巴馬汀、藥根堿、小檗堿),UV響應(yīng)值也存在不同,但一測多評法利用數(shù)學(xué)上的轉(zhuǎn)換關(guān)系推算校正因子,并不關(guān)乎化學(xué)結(jié)構(gòu)是否異同,故而雖然每個成分都不能實現(xiàn)最優(yōu)的波長檢測,但在一定含有量范圍內(nèi)仍然是可以實現(xiàn)較為準(zhǔn)確的定量。

    黃柏中小檗堿與其他生物堿相比含有量差異很大,一次分離測定常導(dǎo)致低含有量成分低于檢測靈敏度或超出線性范圍,很難同時兼顧。同時,多組分定量測定中無法兼顧各組分選用最佳波長,確實會降低各組分的定量限,但在本實驗中的30個樣品中并未受到該因素的影響,相比每個成分單獨(dú)測定而言,換來了較高的分析效率。在對照品缺乏的情況下,此方法可以作為一個新模式用于黃柏藥材的多成分定量。

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