工程酵母細(xì)胞高壓破碎、蛋白低溫保藏和去糖基化處理對(duì)7-木糖紫杉烷糖基水解酶LXYL-P1-2活性的影響

陳天嬌，朱平

?

工程酵母細(xì)胞高壓破碎、蛋白低溫保藏和去糖基化處理對(duì)7-木糖紫杉烷糖基水解酶LXYL-P1-2活性的影響

陳天嬌，朱平

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)天然藥物生物合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

紫杉醇主要來(lái)源于紅豆杉，作為一種“重磅炸彈”式的抗腫瘤藥物，自 1992 年 12 月被美國(guó) FDA 批準(zhǔn)上市以來(lái)，一直是銷(xiāo)售額最大的植物抗腫瘤藥。但由于紫杉醇的天然含量極低，約占含量最高的樹(shù)皮部位的萬(wàn)分之二，加之紅豆杉生長(zhǎng)緩慢，早期從野生紅豆杉中獲取紫杉醇曾給紅豆杉資源造成毀滅性破壞。目前主要依靠化學(xué)半合成或苗圃栽培手段制取。苗圃栽培雖然對(duì)保護(hù)野生紅豆杉資源具有積極意義，但栽培紅豆杉中紫杉醇含量低微的本質(zhì)沒(méi)有發(fā)生改變。另一方面，紅豆杉中存在著大量的紫杉醇結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，其中包括含量數(shù)十倍于紫杉醇的 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇，而后者在脫除木糖基之后形成的 10-去乙酰紫杉醇僅需在 C10 位乙?；纯僧a(chǎn)生紫杉醇[1]。如能將這類(lèi)副產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成紫杉醇，不僅可以減少其對(duì)環(huán)境的污染，還可以“變廢為寶”，大大提高紅豆杉資源的利用率。脫除木糖基可用化學(xué)法或生物酶法來(lái)完成，其中后者的專(zhuān)一性強(qiáng)、環(huán)境友好。但由于天然細(xì)胞中 β-木糖苷酶的酶量普遍偏低，用篩選得到的微生物直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化效率不高[2-3]，本實(shí)驗(yàn)室已嘗試用基因工程方法解決這一問(wèn)題。我們已從具有轉(zhuǎn)化 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇為 10-去乙酰紫杉醇能力的真菌香菇中克隆得到了 7-木糖紫杉烷糖基水解酶 LXYL-P1-2，該酶隸屬于糖基水解酶的第 3 家族，是一種全新的和雙功能的 β-木糖苷酶和 β-葡萄糖苷酶，能高效且專(zhuān)一性地水解包括 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇在內(nèi)的 7-木糖紫杉烷的木糖基，生成相應(yīng)的 7-羥基紫杉烷。已對(duì)該酶及其重組菌開(kāi)展了酶的表征、高密度發(fā)酵與生物催化等研究[4-6]。本文報(bào)告工程酵母細(xì)胞高壓破碎條件、蛋白低溫保藏和去糖基化處理對(duì) LXYL-P1-2 酶活性的影響，為利用純化的重組酶進(jìn)行酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系等的研究提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 重組畢赤酵母 GS115-3.5K-P1-2 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2 試劑與溶液 β-木糖苷酶通用的生色底物對(duì)硝基苯基-β-D-木糖苷（p-nitropheny-β-D-xylopyranoside，PNP-Xyl）和標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白（BSA）均購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；蛋白酶抑制劑 Cocktail Set III（無(wú)EDTA）購(gòu)自美國(guó) Merck Millipore 公司；糖苷內(nèi)切酶Endo Hf 購(gòu)自美國(guó) New England BioLabs 公司；蛋白定量染色液購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司；配制以下蛋白純化溶液：

Buffer A：2 ml 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、25 ml 2 mol/L KCl、2 ml 1 mol/L 咪唑、69.44 μl 14.4 mol/L β-巰基乙醇、10 ml 甘油，加蒸餾水定容至 100 ml；

Buffer B：2 ml 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.5）、5 ml 2 mol/L KCl、69.44 μl 14.4 mol/L β-巰基乙醇、10 ml 甘油，加蒸餾水定容至 100 ml；

Buffer C：2 ml 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.5）、5 ml 2 mol/L KCl、69.44 μl 14.4 mol/L β-巰基乙醇、10 ml 甘油，加蒸餾水定容至 80 ml；

各種濃度的咪唑洗脫液：用 Buffer C 作為溶劑對(duì)1 mol/L 咪唑進(jìn)行稀釋獲得。

1.1.3 設(shè)備與儀器 APV-2000 型高壓細(xì)胞破碎儀購(gòu)自德國(guó) SPX 公司；P300 型超微量分光光度計(jì)購(gòu)自德國(guó)Implen 公司；鎳親和層析填料購(gòu)自美國(guó) GE Healthcare 公司；島津Labsolution 分析型高效液相工作站購(gòu)自日本 Shimadzu 公司；電熱恒溫水箱購(gòu)自北京長(zhǎng)風(fēng)公司；FE 20 型 pH 計(jì)購(gòu)自瑞士 Mettler 公司；Zorbax Bio Series GR-450 分離柱購(gòu)自美國(guó) Agilent 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞破碎條件優(yōu)化

1.2.1.1 菌體處理和細(xì)胞破碎 取 20 g 冷干后的 GS115-3.5K-P1-2 菌體粉末浸泡于 140 ml 的 Tris-HCl（20 mmol/L，pH 8.0）緩沖液中，并加入 700 μl 蛋白酶抑制劑，充分混勻。待系統(tǒng)冷卻到 4 ℃后，120 MPa 壓力條件下對(duì) GS115-3.5K-P1-2 酵母細(xì)胞進(jìn)行高壓破碎，分別在破碎 5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 次時(shí)取樣。13 500 ×離心 30 min，檢測(cè)上清液的木糖苷酶活性性并對(duì)目的蛋白進(jìn)行分離純化。

1.2.1.2 酶活力測(cè)定方法 取 10 μl 蛋白上清液與 50 μl 5 mmol/L PNP-Xyl 混勻，50 ℃、pH 5.0 條件下反應(yīng) 20 min 后加入 1 ml 飽和硼酸鈉終止反應(yīng)，405 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值。

1.2.1.3 鎳親和層析法初步純化 LXYL-P1-2 蛋白 高壓破碎后的上清液用 0.45 μm 濾膜過(guò)濾，每份樣品約 15 ml 初始蛋白液。鎳親和層析過(guò)程以 2 ml/min 流速進(jìn)行，首先用 60 ml 去離子水沖洗 20 ml 鎳親和層析柱，再用 60 ml Buffer A 平衡鎳親和層析柱，平衡后將 15 ml 蛋白樣品全部上樣，用 100 ml Buffer A 沖洗純化柱，用 100 ml Buffer B 繼續(xù)沖洗純化柱。配制不同濃度的咪唑洗脫液，分別用 60、200 mmol/L 咪唑?qū)δ康牡鞍走M(jìn)行洗脫，每個(gè)濃度洗脫 60 ml，通過(guò)活性跟蹤的方法收集 60 mmol/L 咪唑濃度下的目的蛋白洗脫組分[7]，并用孔徑為 30 kD 的超濾管于 4000 ×條件下進(jìn)行濃縮。

1.2.1.4 制備型高效液相色譜純化 LXYL-P1-2 蛋白 超濾濃縮后的蛋白樣品用0.45 μm 的濾器過(guò)濾，備用。首先用含 0.1 mol/L 氯化鈉的 0.1 mol/L 磷酸鉀緩沖液（pH 8.0）作為流動(dòng)相平衡 Agilent Zorbax Bio Series GF-450 分離柱，流速 1 ml/min，30 min。每次上樣 500 μl 后用上述緩沖液以 0.5 ml/min 的流速?zèng)_洗柱子，220 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)條件下收集活性峰。

1.2.1.5 測(cè)定純化后的 LXYL-P1-2 蛋白濃度 以 Bradford法檢測(cè)目的蛋白濃度。用去離子水將 BSA 配成 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/ml 濃度梯度溶液，以去離子水為空白對(duì)照。分別取 100 μl 各濃度 BSA 溶液和待測(cè)樣品溶液到干凈試管中，平行做兩管，加 5 ml 染色液（用去離子水將母液稀釋 5 倍，預(yù)先混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用），混勻。室溫放置 10 min 后，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 595 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)，得到 BSA 蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀出待測(cè)樣品的蛋白濃度。

1.2.1.6 LXYL-P1-2 比活力測(cè)定 LXYL-P1-2 酶活力單位（U）定義為：在 50 ℃，pH 5.0，以PNP-Xyl 為底物的條件下，每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 對(duì)硝基苯酚所需要的酶量。按照 1.2.1.2 的方法測(cè)定酶活性。根據(jù) Lambert-Beer 定律，吸光值= εbc[ε：摩爾消光系數(shù)，對(duì)硝基苯酚的摩爾消光系數(shù)為 17 500 L/(mol·cm)；b：比色皿寬度，為 1 cm；c：吸光物質(zhì)摩爾濃度]，因此在上述總體積為 1.060 ml 的反應(yīng)體系中，單位體積 LXYL-P1-2 的酶活力（U/ml）=405× 302.86。LXYL-P1-2 糖基化蛋白的分子量約為 120 kD，根據(jù)測(cè)得的蛋白質(zhì)量濃度，求出單位為 U/μmol 的酶比活力。

1.2.2 LXYL-P1-2低溫保藏效果檢測(cè) 測(cè)定制備純化后 LXYL-P1-2 蛋白的木糖苷酶活力，將部分蛋白溶液分別于 4、–80 ℃下保存 35、70 d，測(cè)定低溫保藏后的酶活力并與保藏前的數(shù)據(jù)相比較，明確 LXYL-P1-2 蛋白低溫保藏的效果。

1.2.3 去糖基化對(duì) LXYL-P1-2 酶活力的影響 LXYL-P1-2 的去糖基處理參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。取部分 1.2.2 中獲得的鎳親和層析后的蛋白溶液，經(jīng) 30 kD 的超濾管在 4000 ×條件下將其濃縮到 2 mg/ml，用糖苷內(nèi)切酶 Endo Hf 在 37 ℃條件下對(duì) LXYL-P1-2 進(jìn)行去糖基化處理 12 h，LXYL-P1-2 去糖基反應(yīng)體系：2 mg/ml 的 LXYL-P1-2 蛋白樣品 400 μl，與 50 μl 10 × G5 Buffer 和 25 μl Endo Hf 混合，加水補(bǔ)齊總體系到 500 μl。

分別以未經(jīng)上述處理的 LXYL-P1-2 和不加 Endo Hf、但同樣在 37 ℃條件下孵育 12 h 的 LXYL-P1-2 作為對(duì)照。去糖基之后的 LXYL-P1-2 經(jīng)質(zhì)譜分析，其分子量約為 92 kD（說(shuō)明仍有部分糖基殘留）[4]。根據(jù)測(cè)得的蛋白質(zhì)量濃度，求出單位為 U/μmol 的比活力。

2 結(jié)果

2.1 GS115-3.5K-P1-2 酵母細(xì)胞破碎研究

如圖 1 所示，通過(guò)對(duì)不同破碎次數(shù)的樣品上清液和純化后的目的蛋白進(jìn)行活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)菌液在破碎 10 次的情況下上清液中的單位體積酶活力達(dá)到最大值，而比活力與破碎 5 次的樣品基本相似且與用試劑盒提取的純酶比活力相當(dāng)（試劑盒提取的純酶比活力約為 4.5 × 104U/mg，相當(dāng)于 5.3 × 106U/μmol）。在破碎 20、30、40 次情況下，盡管隨著破碎次數(shù)的增加總蛋白釋放量可能有所增加，但單位體積酶活力基本保持與破碎 10 次的一致，而比活力則一直在降低。之后，隨著破碎次數(shù)的增加，單位體積酶活力和比活力均急劇下降，到破碎 80 次時(shí)酶活力所剩無(wú)幾。分析原因，可能是由于隨著細(xì)胞破碎次數(shù)的增加造成酶溶液所處的溫度不斷上升，從而導(dǎo)致酶變性失活增加。破碎 10 次后細(xì)胞已基本破碎完全，綜合上述結(jié)果最終確定了破碎 10 次作為 APV-2000 型高壓細(xì)胞破碎儀的最佳破碎條件。

單位體積酶活力（× 102 U/ml）9.0 7.5 6.0 4.5 3.0 1.5 0.06.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0酶比活力（× 106 U/μmol） 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 破碎次數(shù)

2.2 LXYL-P1-2 純酶溶液長(zhǎng)時(shí)間低溫保藏效果研究

將純化后的 LXYL-P1-2 純酶溶液分別置于 4 ℃和–80 ℃保存。結(jié)果如圖 2 所示，保存 35 d 后，在 4 ℃條件下酶活力降低了 19.7%，而在–80 ℃條件下僅下降了 4.5%；當(dāng)同樣的蛋白樣品在–80 ℃保存天數(shù)達(dá)到 70 d 時(shí)，酶活力降低了 18.1%。說(shuō)明LXYL-P1-2 純酶溶液保存在–80 ℃時(shí)一般不宜超過(guò) 35 d，此段時(shí)間內(nèi)可保持酶活力的穩(wěn)定。另外，長(zhǎng)期低溫保藏 LXYL-P1-2 蛋白應(yīng)選擇其粉末形式。

酶比活力（× 106 U/μmol）6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 初始值 4 ℃ –80 ℃ –80 ℃35 d 35 d 70 d 儲(chǔ)存條件

2.3 去糖基化對(duì) LXYL-P1-2 酶活力的影響

前期研究發(fā)現(xiàn)，去糖基的 LXYL-P1-2 蛋白是有活性的，后續(xù)的蛋白結(jié)晶研究也主要是用其去糖基的形式。然而，糖基的有無(wú)究竟對(duì)該蛋白的活性有多大影響一直缺乏實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)在對(duì)糖基化的 LXYL-P1-2 蛋白進(jìn)行37 ℃、12 h 溫育（不加 Endo Hf）的同時(shí)，在相同溫度和時(shí)間條件下用 Endo Hf 水解 LXYL-P1-2 以制備去糖基的 LXYL-P1-2 蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 3 所示，糖基化的 LXYL-P1-2 蛋白經(jīng)過(guò) 37 ℃、12 h 溫育后活性下降了約 3.9%，而去糖基的 LXYL-P1-2 則下降 4.6%，兩者相差 0.7%，說(shuō)明，LXYL-P1-2 蛋白糖基化與否不會(huì)對(duì)其活性產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性的影響，在去糖基處理過(guò)程中該蛋白活性的輕微下降，推測(cè)是由于 37 ℃條件下極小量蛋白變性失活所致。

酶比活力（× 106 U/μmol）5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 對(duì)照 37 ℃ 12 h 去糖基 處理方法

3 討論

在提取紫杉醇的過(guò)程中，作為副產(chǎn)物的7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的收率可達(dá) 0.5% 以上[8]，是紫杉醇的幾十倍。LXYL-P1-2 能高效、專(zhuān)一性地從 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇上脫去木糖基生成 10-去乙酰紫杉醇，因此，LXYL-P1-2 在7-木糖-10-去乙酰紫杉醇“變廢為寶”的過(guò)程中能夠發(fā)揮十分重要的作用，有必要對(duì)其開(kāi)展深入的研究。

在對(duì) LXYL-P1-2 進(jìn)行酶學(xué)特性以及結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究過(guò)程中，高純度且保持活性的酶蛋白是開(kāi)展相關(guān)研究的物質(zhì)基礎(chǔ)和前提條件。重組酵母 GS115-3.5K-P1-2 通過(guò)胞內(nèi)表達(dá)及非分泌形式產(chǎn)生重組酶蛋白 LXYL-P1-2（注：即使通過(guò)分泌型載體如 pPIC9K 將該基因?qū)氘叧嘟湍?，重組蛋白仍主要滯留在酵母細(xì)胞內(nèi)），因此，細(xì)胞破碎是制備該蛋白的第一步，相比用試劑盒進(jìn)行細(xì)胞破碎，高壓細(xì)胞破碎儀對(duì)細(xì)胞的破碎更為徹底且收率更高[9]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞破碎效果的研究表明，用 APV-2000 型高壓細(xì)胞破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎時(shí)，最適破碎次數(shù)為 10 次，此時(shí)的蛋白釋放量和蛋白活性均保持在接近最高的水平。

在得到高純度的 LXYL-P1-2 蛋白之后，適當(dāng)?shù)谋２胤椒梢杂行П３制浠钚裕阌陂_(kāi)展后續(xù)的研究。通過(guò)對(duì)純化后的 LXYL-P1-2 蛋白溶液進(jìn)行低溫保藏的研究發(fā)現(xiàn)，在 –80 ℃保存 1 個(gè)月的時(shí)間內(nèi) LXYL-P1-2 的催化活性可以基本保持不變，當(dāng)保存 2 個(gè)月之后，大約有 18% 的蛋白變性失活。當(dāng)然，對(duì)于更長(zhǎng)時(shí)間的酶蛋白保藏而言，用冷干的酶蛋白粉末結(jié)合低溫保藏應(yīng)能確保該酶不喪失其活性。在進(jìn)行 LXYL-P1-2 晶體形成及三維結(jié)構(gòu)研究中，發(fā)現(xiàn)糖基化的 LXYL-P1-2 蛋白很難獲得高分辨率的蛋白晶體，而應(yīng)用去糖基的 LXYL-P1-2 蛋白則最終解決了這一難題。前期實(shí)驗(yàn)已證明去糖基的 LXYL-P1-2 蛋白仍具有酶活性，本實(shí)驗(yàn)再次證明，LXYL-P1-2 蛋白糖基的有無(wú)不影響其活性，只是在去糖基過(guò)程中 37 ℃溫度條件可能會(huì)造成極小量酶蛋白的變性失活，但這對(duì)于后續(xù)的相關(guān)研究不會(huì)造成實(shí)質(zhì)性的影響。

[1] Chattopadhyay SK, Sharma RP, Kumar S. Process for the production of important taxol analogues 10-deacetyl taxol A, B, and C: US, 6028206, 2000-02-22.

[2] Hanson RL, Howell JM, Brzozowski DB, et al. Enzymatic hydrolysis of 7-xylosyltaxanes by xylosidase from Moraxella sp. Biotechnol Appl Biochem, 1997, 26:153-158.

[3] Yang L, Luan HW, Liu XB. A cellulosimicrobium cellulans, its hydrolase and in the use of transformation of taxanes: CN, 200710012698.9, 2009-03-11. (in Chinese)

楊凌, 欒宏偉, 劉興寶. 纖維化纖維單胞菌、水解酶及其在紫杉烷轉(zhuǎn)化方面的用途: 中國(guó), 200710012698.9, 2009-03-11.

[4] Cheng HL, Zhao RY, Chen TJ, et al. Cloning and characterization of the glycoside hydrolases that remove xylosyl groups from 7-β-xylosyl-10-deacetyltaxol and its analogues. Mol Cell Proteomics, 2013, 12(8):2236-2248.

[5] Yu WB, Liang X, Zhu P. High-cell-density fermentation and pilot-scale biocatalytic studies of an engineered yeast expressing the heterologous glycoside hydrolase of 7-β-xylosyltaxanes. J Ind Microbiol Biotechnol, 2013, 40(1):133-140.

[6] Wang F, Zhu P.Prediction and preliminary functional analysis of the potential active center of the glycoside hydrolases LXYL-P1-1 and LXYL-P1-2. Mycosystema, 2013, 32(5):846-854. (in Chinese)

王芬, 朱平. 7-木糖紫杉烷糖基水解酶LXYL-P1-1和LXYL-P1-2活性中心預(yù)測(cè)及初步的功能分析. 菌物學(xué)報(bào), 2013, 32(5):846-854.

[7] Park TH, Choi KW, Park CS, et al. Substrate specificity and transglycosylation catalyzed by a thermostable beta-glucosidase from marine hyperthermophile Thermotoga neapolitana. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 69(4):411-422.

[8] Chattopadhyay SK, Sharma RP, Kumar S, et al. A process for the production of taxol: EP, 0905130, 2002-03-06.

[9] Yao HW, Guo SG, Fan YM. Research report on technology of yeast cell disruption. China Brewing, 2005(4):32-34. (in Chinese)

姚洪文, 郭素格, 范玉梅. 酵母細(xì)胞破碎技術(shù)的研究. 中國(guó)釀造, 2005(4):32-34.

國(guó)家自然科學(xué)基金（30770229、31270796）；“重大新藥創(chuàng)制”國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2012ZX09301002-001-005）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金（2012N06）

朱平，Email：zhuping@imm.ac.cn

2014-04-08

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.05.013