自體樹突狀細(xì)胞聯(lián)合抗病毒藥治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎臨床效果研究

金國(guó)賢，孫斌，金碩，曲連軍，張瑜

目前對(duì)乙型肝炎慢性化的傳統(tǒng)治療方法多采用恩替卡韋等抗病毒藥物，通過降解病毒 mRNA直接抑制肝細(xì)胞中的病毒復(fù)制，并間接刺激免疫系統(tǒng)，但病毒的清除率較低，而其他抗病毒藥物雖有效抑制病毒復(fù)制但持續(xù)時(shí)間短，易出現(xiàn)反彈[1]。樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）能夠刺激機(jī)體針對(duì)外界病原體的入侵產(chǎn)生足夠的免疫反應(yīng)，我院在傳統(tǒng)抗病毒治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合自體 DC 對(duì) HBeAg陽性的慢性乙型肝炎（CHB）進(jìn)行治療并與單純抗病毒治療效果進(jìn)行對(duì)比，探討聯(lián)合自體 DC 治療效果是否優(yōu)于單純抗病毒藥物，結(jié)果報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象與材料

1.1.1 研究對(duì)象及分組 選擇 2010年 8月 –2012年 7月間在我院肝炎門診確診的 HBeAg 陽性的 CHB 患者 126 例，17～56 歲，平均 30.2 歲，其中男性 82 例、女性 44 例，CHB 病程 1 ～9年，平均 3.7年，患者持續(xù) HBsAg、HBeAg 及HBV DNA 陽性，其定量高于 105拷貝?ml，ALT >80 IU/L，不合并肝硬化和其他肝炎病毒感染及其嚴(yán)重并發(fā)癥。126 例患者隨機(jī)分為治療組 75 例和對(duì)照組 51 例，兩組生化指標(biāo)和 HBV DNA指標(biāo)相似。治療組獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號(hào)2010.07 倫審第（32）]和患者簽署的知情同意書，采用自體 DC 聯(lián)合恩替卡韋治療，對(duì)照組僅用恩替卡韋治療。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)液、rhGM-CSF、rhIL-4、TNF 購自達(dá)科為生物科技有限公司；鼠抗人 CD80、CD86、HIA-DR 購自北京利文生物科技有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 倒置顯微鏡為日本 Olympus公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱為日本三洋公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀和細(xì)菌培養(yǎng)儀均為美國(guó) BD 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DC 細(xì)胞的獲得 無菌條件下抽取患者靜脈血 50 ml，肝素抗凝。用蘸有 75% 酒精的紗布擦拭靜脈血容器拿至生物安全柜內(nèi)，鹽水 1∶1 稀釋抗凝血，緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液，2000 r/min 離心 20 min，分離單個(gè)核細(xì)胞吸取細(xì)胞層后稀釋，用1600 r/min 離心 11 min，去上清計(jì)數(shù)，重混勻稀釋1000 r/min 洗滌 2 次。將（1～2）× 106/ml濃度的細(xì)胞移至 75 cm2的培養(yǎng)瓶。于 37 ℃，50 ml/L CO2飽和濕度下培養(yǎng) 3 h，棄上清液加 1640 培養(yǎng)液清洗 2～3 次，去除懸浮細(xì)胞，加入有 CSF 和 rhIL-4的培養(yǎng)基，隔日換液，培養(yǎng)至第 6 天加入 HBsAg，4 h 后加入 TNF。繼續(xù) 37 ℃，50 ml/L CO2飽和濕度下培養(yǎng) 1 d，收獲 DC 細(xì)胞，用生理鹽水沖洗后 1200 r/min 離心 10 min，棄上清用鹽水重懸細(xì)胞洗滌 2 次后留樣，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞活性以及無菌檢測(cè)以及流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.2.2 治療方法和觀察指標(biāo) 兩組均采用口服恩替卡韋 0.5 mg/d，治療組在此基礎(chǔ)上給予 DC 治療。于皮下注射和靜脈輸注體內(nèi) DC 懸液各 1 ml，連續(xù) 3 個(gè)月。兩組患者于治療前和治療后 6 個(gè)月檢測(cè)肝功生化指標(biāo)和 HBV-DNA 滴度含量，進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，兩組治療前后及兩組間比較采用 t 檢驗(yàn)和 χ2檢驗(yàn)，P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC 體外培養(yǎng)擴(kuò)增

外周血單核細(xì)胞貼壁 4 h 后獲得黏附細(xì)胞，加入細(xì)胞因子 24 h 后貼壁細(xì)胞減少，懸浮細(xì)胞逐漸增多，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至第 6 天呈積聚現(xiàn)象，并可見到細(xì)胞具有樹突樣突起，臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率達(dá) 95% 以上，細(xì)胞計(jì)數(shù)平均達(dá)到 1×107個(gè)/ml。

圖1 DC 細(xì)胞形態(tài)（A：4 h，× 200；B：6 d，× 400；C：7 d，× 400）Figure1 Image of cultured dendritic cells (A: 4 h,×200; B: 6 d,×400; C: 7 d,×400)

圖2 CD80+/CD86+ 流式檢測(cè)對(duì)照?qǐng)DFigure2 CD80+/CD86+ flow cytometry control image

圖3 CD80+/CD86+ 流式檢測(cè)圖Figure3 CD80+/CD86+ flow cytometry image

圖4 CD80+/HLA-DR流式檢測(cè)對(duì)照?qǐng)DFigure4 CD80+/HLA-DR flow cytometry control image

圖5 CD80+ /HLA-DR 流式檢測(cè)圖Figure5 CD80+ /HLA-DR flow cytometry image

2.2 HBsAg 致敏 DC 細(xì)胞

培養(yǎng)至第 6 天，加入 HBsAg 4 h 后再加入TNF 繼續(xù)培養(yǎng) 1 d。收獲前細(xì)胞形態(tài)如圖 1 所示。

2.3 成熟 DC 細(xì)胞的特征標(biāo)志

收獲的 DC 細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè) DC 表面 CD80、CD86、HLA-DR 的表達(dá)，見圖 2～5。

治療 6 個(gè)月后，治療組和對(duì)照組 ALT 和AST 均降到了正常范圍，HBeAg/抗-HBe 血清轉(zhuǎn)換率分別為 30.62%（23/75）和 21.4%（11/51）。經(jīng) χ2檢驗(yàn) P < 0.05（表 1）。

治療后 6 個(gè)月，治療組和對(duì)照組 HBV-DNA滴度分別為（0.500 ± 0.06）× 103拷貝/ml 和（1.400± 0.12）× 103拷貝/ml，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表 2）。

表1 治療前后兩組生化指標(biāo)測(cè)定比較（U/L）Table1 Comparison of biochemical parameters after treatment (U/L)

表2 治療前后兩組 HBV-DNA 測(cè)定結(jié)果的比較（拷貝/ml）Table2 Comparison of HBV-DNA after treatment (copies/ml)

3 討論

樹突狀細(xì)胞是人類最重要的抗原提呈細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞免疫的功效是其他抗原提呈細(xì)胞的數(shù)十倍[2]。免疫功能不全，機(jī)體對(duì)感染的 HBV 處于持續(xù)免疫耐受狀態(tài)是乙型肝炎慢性化的主要原因之一[3]。

HBeAg 陽性慢性乙型肝炎（CHB）具有病程短、炎癥活動(dòng)明顯、病毒復(fù)制活躍，患者相對(duì)年輕等特點(diǎn)[4-5]。以往對(duì) HBeAg 陽性慢性乙型肝炎的治療多采用 α-干擾素和乙肝病毒復(fù)制抑制劑如恩替卡韋、拉米夫定等藥物，短時(shí)期對(duì)病毒有一定的抑制作用，但長(zhǎng)期服用易導(dǎo)致抗藥性突變體的發(fā)生，病毒復(fù)制量反彈，宿主的免疫系統(tǒng)未能得到根本的改善和調(diào)節(jié)，不能產(chǎn)生有效的細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞（CTL）效應(yīng)[6-7]。

樹突狀細(xì)胞是起源于骨髓的最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，具有啟動(dòng) T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答功能，對(duì)體內(nèi)靜息 T 細(xì)胞激活效率最高[8]。研究表明樹突狀細(xì)胞還具有增強(qiáng) NK 細(xì)胞的功能[9-10]。近年來研究表明，造成慢性肝炎免疫耐受的原因是患者體內(nèi)樹突狀細(xì)胞抗原遞呈功能缺陷，不能把病毒抗原的信號(hào)傳遞給機(jī)體的免疫系統(tǒng)。近幾年對(duì)樹突狀細(xì)胞的免疫功能的研究有了很大的進(jìn)展，特別是體外培養(yǎng)慢性乙型肝炎患者的樹突狀細(xì)胞已應(yīng)用于臨床[11]。本項(xiàng)研究在應(yīng)用恩替卡韋抗病毒藥物治療的同時(shí)，聯(lián)合自體樹突狀細(xì)胞，對(duì) 75 例 HBeAg 陽性的慢性乙型肝炎患者進(jìn)行治療，并與單純應(yīng)用恩替卡韋治療的對(duì)照組進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組在降低 HBV-DNA 滴度方面明顯優(yōu)于對(duì)照組，提示自體 DC 具有抑制患者體內(nèi)病毒復(fù)制，降低血清病毒載量作用，經(jīng)過體外培養(yǎng)的 DC 可增強(qiáng)慢性乙型肝炎患者免疫功能，達(dá)到抑制 HBV 病毒的作用。

HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換率是目前診斷慢性 HBV感染者免疫系統(tǒng)控制 HBV 感染能力和接近臨床治愈狀態(tài)的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[12]。本項(xiàng)研究治療組HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換率（30.62%）高于對(duì)照組（21.4%），提示自體樹突狀細(xì)胞不僅能降低HBV-DNA 載量，改善肝臟功能，也能提高 HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率。治療組和對(duì)照組 ALT 和 AST 三個(gè)月均降至正常范圍，兩組無顯著差異。

本項(xiàng)研究結(jié)果表明恩替卡韋聯(lián)合自體 DC 可增強(qiáng)慢性乙型肝炎患者的免疫力，并對(duì)病毒復(fù)制具有明顯抑制作用，能夠提高 HBeAg 血清轉(zhuǎn)換率。遠(yuǎn)期療效有待進(jìn)一步隨訪觀察。

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