靈長類尿酸酶假基因化機制及其與靈長類進化關系研究進展

趙百學，陳建華

尿酸酶是生物體內(nèi)嘌呤代謝途徑中的一種氧化酶，廣泛分布于自然界多種物種體內(nèi)，主要介導尿酸氧化降解的酶促反應[1-3]。自然界內(nèi)的絕大多數(shù)哺乳動物具有功能型尿酸酶，而部分靈長類（大型猿類、人類）尿酸酶基因由于進化中突變事件而成為假基因不能表達功能型尿酸酶，因此后者血清內(nèi)尿酸水平比前者高 3～10 倍[4-5]，這也是人類是唯一容易罹患痛風的哺乳動物的主要原因。近年來痛風在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈上升趨勢，而臨床上的治療藥物比較匱乏[6]。尿酸酶類藥物可以快速降解人血清中尿酸從而有效地治療痛風，但是目前臨床上使用的均是外源性尿酸酶，強烈的免疫原性限制了其使用[7]。研究靈長類尿酸酶基因失活的機制從而恢復其活性對于低免疫原性抗痛風藥物的開發(fā)無疑是一條新思路。目前，靈長類尿酸酶失活的分子機制還不清楚，本文就靈長類尿酸酶的結(jié)構(gòu)與功能關系、進化失活與自然選擇及其失活的分子機制研究現(xiàn)狀進行綜述。

1 尿酸酶結(jié)構(gòu)與功能關系的研究

不同物種尿酸酶的一級結(jié)構(gòu)差異比較大，氨基酸數(shù)目和同源性都不盡相同，但是高級結(jié)構(gòu)則相對保守。目前研究人員已經(jīng)成功對黃曲霉菌和球形節(jié)桿菌的尿酸酶進行結(jié)晶，并且在不同分辨率層次上獲得了結(jié)構(gòu)模型[8-9]。哺乳動物尿酸酶由于可溶性差導致結(jié)晶困難，因此尚未得到哺乳動物尿酸酶晶體結(jié)構(gòu)。從現(xiàn)有的微生物尿酸酶晶體結(jié)構(gòu)可以看出，尿酸酶活性形式是同源四聚體（圖 1），具有四個相同的活性中心，活性中心位于二聚體的界面處[10]。每個尿酸酶單體由兩個對稱的 T-fold 結(jié)構(gòu)域串聯(lián)形成，兩個尿酸酶單體通過氫鍵結(jié)合形成桶狀的二聚體結(jié)構(gòu)，兩個二聚體再通過氫鍵形成活性形式的四聚體尿酸酶。二聚體的界面處通過疏水氨基酸的相互作用形成口袋狀的疏水核心，該結(jié)構(gòu)是尿酸酶的活性中心負責底物的定位和 O2的結(jié)合[11-14]。

哺乳動物的尿酸酶也是保守的同源四聚體結(jié)構(gòu)，與微生物尿酸酶整體結(jié)構(gòu)差異不大，而相鄰單體形成二聚體時的環(huán)形構(gòu)象則差異很大，但是活性位點的氨基酸殘基則高度保守。Kratzer 等[15]通過對哺乳動物尿酸酶的進化史進行分析構(gòu)建出了高活性的哺乳動物祖先尿酸酶，結(jié)合多物種尿酸酶蛋白序列比對，推測出從祖先尿酸酶到現(xiàn)今的人尿酸酶進化過程中產(chǎn)生了 22 個對酶活性有害氨基酸錯義突變位點。

Kratzer 的研究結(jié)果顯示，Phe222/Ser232/Tyr240 這3 個氨基酸殘基對于祖先尿酸酶活性中心的 α4-α5 元件的形成至關重要，若發(fā)生錯義突變則會導致底物尿酸不能在活性位點正確定位。S232L 置換后喪失與 Gly169 形成氫鍵的能力，從而導致 Phe170 和 Gln236 空間取向錯誤和活性中心不能正確形成，最終導致底物不能在活性中心正確定位。Y240C 的置換導致活性中心附近的疏水氨基酸不能正常折疊進而影響二聚體的正確締合。P222A 的置換導致活性中心的極性增強從而影響疏水口袋的形成和二聚體之間的相互作用。此外，其他的 19 個氨基酸的置換也都會影響尿酸酶的折疊和活性中心的形成。

圖1 黃曲霉尿酸酶晶體結(jié)構(gòu)模型[10]（A：黃曲霉尿酸酶同源四聚體模型；B：黃曲霉尿酸酶單體結(jié)構(gòu)模型）

2 尿酸酶失活與古靈長類進化

多項研究表明靈長類尿酸酶的失活對于古靈長類的進化具有選擇優(yōu)勢。最新的研究表明哺乳動物在果糖的存在下，尿酸可以促進機體脂肪的積累[16]。靈長類的尿酸酶失活起始于始新世，到中新世的初期徹底失活。在地質(zhì)窗口期全球氣候逐漸變冷，古靈長類可以獲得的果實性食物逐漸減少。此時尿酸酶的失活使得其體內(nèi)尿酸水平升高，促進古靈長類從植物果實中攝取的果糖在肝臟中轉(zhuǎn)化成脂肪并儲存下來，而脂肪的積累可以幫助古靈長類度過地球寒冷的食物匱乏期[17-18]?，F(xiàn)代人類生活條件的改善使得人均果糖日攝取量遠高于古靈長類，同時由于尿酸酶失活導致血清尿酸水平升高，因此肥胖癥在全球范圍內(nèi)流行。這也間接表明了尿酸酶的失活對于古靈長類度過地球地質(zhì)窗口期具有進化優(yōu)勢。

在始新世的早期，地球氣候溫暖，古靈長類可以獲得較多的果實性食物，該類食物中含有豐富的抗壞血酸（Vc）。Vc 是一種有效的抗氧化劑可以維持靈長類體內(nèi)的抗氧化水平，因此始新世早期的古靈長類沒必要通過浪費自身能量合成 Vc。在這一時期 Vc 合成途徑最后一步反應催化酶基因失活成為假基因?qū)е鹿澎`長類不再合成 Vc[19-20]，這也是基因節(jié)儉學說的有力證據(jù)。始新世后期地球氣候逐漸變冷，古靈長類可獲得的果實性食物減少，為了維持體內(nèi)足夠的抗氧化水平，在這一時期古靈長類尿酸酶失活使體內(nèi)尿酸水平升高。尿酸是有效的抗氧化劑，有效地補償了古靈長類體內(nèi)Vc 合成途徑的缺失。

另外，尿酸與咖啡因具有相似的化學結(jié)構(gòu)，可以刺激大腦皮層的應激反應[21]，因此推測靈長類的尿酸酶失活促進古靈長類智力的進化[22]。尿酸在靈長類體內(nèi)還具有提高血壓的作用，古人類向現(xiàn)代人進化時直立行走需要較高的血壓維持腦部供血，因此推測尿酸酶失活促進古靈長類直立行走能力的進化。

3 靈長類尿酸酶失活的分子機制

靈長類尿酸酶失活的分子機制還不清楚，研究人員使用RNA 雜交的方法在人肝臟細胞內(nèi)檢測到了尿酸酶基因的轉(zhuǎn)錄體，對其 cDNA 測序發(fā)現(xiàn)在 33 和 187 位密碼子發(fā)生了無義突變，但是消除這兩個無義突變依然不能恢復人尿酸酶活性[23]，可見尿酸酶失活是一個比較復雜的過程。目前關于靈長類尿酸酶失活機制的主流觀點是：靈長類尿酸酶失活是漸進性活性下降的過程。研究人員曾對小鼠的尿酸酶基因進行基因敲除，該敲除型小鼠血清尿酸水平較正常小鼠急劇升高，并很快死于高尿酸型腎病，但是通過喂服尿酸生成抑制藥物則可以延長該類小鼠的壽命[24]。因此這也間接表明靈長類尿酸酶失活更可能是漸進性進化事件。

學術界對于靈長類尿酸酶漸進性失活機制也有分歧。一部分研究人員認為靈長類尿酸酶失活首先發(fā)生在啟動子區(qū)，啟動子區(qū)序列突變導致尿酸酶的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，宏觀表現(xiàn)為古靈長類體內(nèi)尿酸酶活性下降[25]。另外一部分研究人員認為靈長類尿酸酶失活首先發(fā)生在編碼區(qū)，編碼區(qū)內(nèi)發(fā)生多個有害的氨基酸突變導致其活性的逐步降低最終沉默成為假基因。多項研究表明古靈長類尿酸酶編碼區(qū)首先發(fā)生活性有害突變更可能是靈長類尿酸酶失活的機制[15,26]。Kratzer 等[15]分析了哺乳動物尿酸酶進化史，通過構(gòu)建哺乳動物祖先尿酸酶及其突變體來模擬哺乳動物尿酸酶的進化軌跡。從圖 2可以看出哺乳動物祖先尿酸酶基因編碼區(qū)逐漸發(fā)生突變導致其活性降低，靈長類尿酸酶的失活起始于古猿類祖先的形成，即 15.7 Ma（百萬年）。人尿酸酶假基因含有 3 個明顯的有害突變：33 位密碼子無義突變（猩猩、大猩猩、黑猩猩、人類共有）；187 位密碼子無義突變（人類、黑猩猩共有）；2 號內(nèi)含子序列剪切受體位點異常突變（人、黑猩猩共有）。而長臂猿尿酸酶假基因在 2 號外顯子有 12 bp 的堿基缺失導致移碼突變并且在 18 號密碼子處發(fā)生無義突變，因此是獨立的進化事件。

圖2 尿酸酶基因家族的系統(tǒng)進化以及古老尿酸酶酶活性特點[15]（An19～An33：哺乳動物尿酸酶的進化軌跡。[ ]中的數(shù)字表示上一級物種尿酸酶進化到下一級物種尿酸酶發(fā)生突變的數(shù)目；2,411～< 10 表示尿酸酶的特異性；7.08×105*～n.d.表示尿酸酶催化效率）

Zhang 等[26]通過構(gòu)建人-犬尿酸酶嵌合體、序列比對和同源模建分析了靈長類尿酸酶的進化機制，他們認為古靈長類尿酸酶首先在 119 位發(fā)生錯義突變使其活性降低，然后發(fā)生了 33 位無義突變使其徹底沉默，這也印證了靈長類尿酸酶漸進性失活突變的推測。另外與微生物相比，哺乳動物尿酸酶高頻率的使用 CGA 編碼精氨酸，而導致發(fā)生終止突變的概率增加（CGA-TGA），這可能暗示了哺乳動物尿酸酶具有失活的趨勢，同時這也與物種進化的程度相符合。

4 靈長類尿酸酶失活與現(xiàn)代人疾病

人尿酸酶假基因在肝臟細胞中可以轉(zhuǎn)錄，但是由于 33和 187 號密碼子的無義突變，因此不能正常表達功能型尿酸酶，并且由于無義突變的摻入導致人尿酸酶轉(zhuǎn)錄體也不穩(wěn)定。研究人員曾糾正這兩個無義突變，但是未能恢復尿酸酶的活性。靈長類尿酸酶蛋白編碼區(qū)在進化中還發(fā)生多個有害突變導致不能形成活性形式的四聚體。由于人尿酸酶的假基因化而不能表達功能型尿酸酶，因此人體內(nèi)具有更高的血清尿酸水平。過高的尿酸水平會導致高尿酸血癥，長期的高尿酸血癥會形成痛風[27]。痛風的形成與多種因素有關，如：過食富含嘌呤的食物、酗酒、年齡、性別等[28]。隨著生活水平的提高，痛風在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率逐年升高。長期高尿酸血癥還會形成腎結(jié)石。腫瘤患者化療后，大量的細胞死亡釋放出大量的 DNA 和 RNA 使患者體內(nèi)尿酸水平急劇升高，若不加處理則會導致急性腎衰竭[29]。人體內(nèi)長期高位的尿酸水平也與代謝綜合征、心血管疾病的發(fā)病有關。因此，靈長類尿酸酶失活曾經(jīng)對于古靈長類的進化具有選擇優(yōu)勢，但是現(xiàn)今則更容易使人類罹患痛風等疾病，而開發(fā)尿酸酶藥物則可以有效地補償人尿酸酶的缺失造成的相關疾?。ㄍ达L、高尿酸血癥、代謝綜合征等）。

5 國內(nèi)外尿酸酶藥物的開發(fā)現(xiàn)狀與趨勢

目前，臨床上治療痛風和高尿酸血癥的藥物比較匱乏，并且長期使用后產(chǎn)生的嚴重副作用會降低患者的依從性甚至停用。尿酸酶類藥物可以快速降低血清尿酸水平，甚至溶解已經(jīng)形成的痛風石，具有其他化學藥物難以比擬的優(yōu)點。但是，臨床上使用的尿酸酶類抗痛風藥物均是外源性治療蛋白，無法避免的免疫原性限制了其在痛風治療中的應用。目前，國內(nèi)外對于復活人尿酸酶或者構(gòu)建人-哺乳動物嵌合尿酸酶進行了大量研究以期開發(fā)出低免疫原性的尿酸酶藥物，而且結(jié)果表明這種方式具有很好的可行性。

目前已經(jīng)上市的尿酸酶藥物有豬-狒狒尿酸酶嵌合體（pegloticase）和重組黃曲霉尿酸酶兩種[30-31]，而國內(nèi)還沒有進入臨床的尿酸酶類藥。Pegloticase 主要用于難治性痛風的治療，長期使用會產(chǎn)生嚴重的副反應（發(fā)熱、胃腸道不適等），后者主要用于腫瘤崩解綜合征的治療。當前，國外主要集中于靈長類尿酸酶復活與哺乳動物-靈長類尿酸酶嵌合體的研究，其主要目的是在保持較高的酶活性前提下盡可能地提高與人尿酸酶的同源性，可以看出與人親緣關系更近的尿酸酶藥物則更具開發(fā)和應用價值。其中，F(xiàn)DA 在 2010年批準的 pegloticase 比較巧妙地利用了豬尿酸酶高活性和狒狒尿酸酶與人高親緣性的特點。Fan 等[32]研究了人與犬尿酸酶的嵌合體，該嵌合體尿酸酶在特定的位置進行氨基酸置換修飾，初步研究表明具有更好的穩(wěn)定性和藥理活性。還有研究人員在研究人尿酸酶復活的過程中獲得一些與人尿酸酶高度同源的（> 90%）尿酸酶突變體，這些突變體具有較高的酶活性，并且可以使用 PEG 修飾的手段進一步降低免疫原性[33]。

目前，用于痛風治療的尿酸酶藥物開發(fā)一般基于對哺乳動物尿酸酶 PEG 修飾，但是 PEG 修飾后一般會造成酶活性的較大損失，并且長時間使用 PEG 修飾蛋白，修飾用的PEG 也會誘導人體內(nèi)的免疫反應。因此，目前臨床使用的尿酸酶藥物最大的局限性便在于難以避免的免疫原性。所以，進一步研究靈長類尿酸酶失活機制，復活人尿酸酶或研發(fā)與人尿酸酶親緣更近的高活性尿酸酶是開發(fā)低免疫原性尿酸酶藥物的重要方向。

[1] Kahn K, Tipton PA.Spectroscopic characterization of intermediates in the urate oxidase reaction.Biochemistry, 1998, 37(33):11651-11659.

[2] Johnson RJ, Sautin YY, Oliver WJ, et al.Lessons from comparative physiology: could uric acid represent a physiologic alarm signal gone awry in western society.J Comp Physiol B, 2009, 179(1):67-76.

[3] Ramazzina I, Folli C, Secchi A, et al.Completing the uric acid degradation pathway through phylogenetic comparison of whole genomes.Nat Chem Biol, 2006, 2(3):144-148.

[4] Keebaugh AC, Thomas JW.The evolutionary fate of the genes encoding the purine catabolic enzymes in hominoids, birds, and reptiles.Mol Biol Evol, 2010, 27(6):1359-1369.

[5] Oda M, Satta Y, Takenaka O, et al.Loss of urate oxidase activity in hominoids and its evolutionary implications.Mol Biol Evol, 2002,19(5):640-653.

[6] Edwards NL, So A.Emerging therapies for gout.Rheum Dis Clin North Am, 2014, 40(2):375-387.

[7] Lipsky PE, Calabrese LH, Kavanaugh A, et al.Pegloticase immunogenicity: the relationship between efficacy and antibody development in patients treated for refractory chronic gout.Arthritis Res Ther, 2014, 16(2):R60.

[8] Oksanen E, Blakeley MP, El-Hajji M, et al.The neutron structure of urate oxidase resolves a long-standing mechanistic conundrum and reveals unexpectedchanges in protonation.PLoS One, 2014, 9(1):e86651.

[9] Girard E, Marchal S, Perez J, et al.Structure-function perturbation and dissociation of tetrameric urate oxidase by high hydrostatic pressure.Biophys J, 2010, 98(10):2365-2373.

[10] Giffard M, Delfosse V, Sciara G, et al.Surfactant poloxamer 188 as a new crystallizing agent for urate oxidase.Cryst Growth Des, 2009,9:4199-4206.

[11] Gabison L, Chopard C, Colloc’h N, et al.X-ray, ESR, and quantum mechanics studies unravel a spin well in the cofactor-less urate oxidase.Proteins, 2011, 79(6):1964-1976.

[12] Gabison L, Chiadmi M, El Hajji M, et al.Near-atomic resolution structures of urate oxidase complexed with its substrate and analogues:the protonation state of the ligand.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2010, 66(Pt 6):714-724.

[13] Retailleau P, Colloc'h N, Vivarès D, et al.Urate oxidase from Aspergillus flavus: new crystal-packing contacts in relation to the content of the active site.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2005,61(Pt 3):218-229.

[14] Colloc’h N, Prangé T.Functional relevance of the internal hydrophobic cavity of urate oxidase.FEBS Letters, 2014, 588(9):1715-1719.

[15] Kratzer JT, Lanaspa MA, Murphy MN, et al.Evolutionary history and metabolic insights of ancient mammalian uricases.Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(10):3763-3768.

[16] Cicerchi C, Li N, Kratzer J, et al.Uric acid-dependent inhibition of AMP kinase induces hepatic glucose production in diabetes and starvation: evolutionary implications of the uricase loss in hominids.FASEB J.[Epub ahead of print]

[17] Johnson RJ, Andrews P.Fructose, uricase, and the back-to-Africa hypothesis.Evol Anthropol, 2010, 19(6):250-257.

[18] Lanaspa MA, Sanchez-Lozada LG, Choi YJ, et al.Uric acid induces hepatic steatosis by generation of mitochondrial oxidative stress:potential role in fructose-dependent and -independent fatty liver.J Biol Chem, 2012, 287(48):40732-40744.

[19] Lachapelle MY, Drouin G.Inactivation dates of the human and guinea pig vitamin C genes.Genetica, 2011, 139(2):199-207.

[20] Drouin G, Godin JR, Pagé B.The genetics of vitamin C loss in vertebrates.Curr Genomics, 2011, 12(5):371-378.

[21] Sutin AR, Cutler RG, Camandola S, et al.Impulsivity is associated with uric acid: evidence from humans and mice.Biol Psychiatry, 2014,75(1):31-37.

[22] Cervini C, Zampa AM.Uric acid and intelligence.Ann Rheum Dis,1982, 41:435.

[23] Yeldandi AV, Yeldandi V, Kumar S, et al.Molecular evolution of the urate oxidase-encoding gene in hominoid primates: nonsense mutations.Gene, 1991, 109(2):281-284.

[24] Kelly SJ, Delnomdedieu M, Oliverio MI, et al.Diabetes insipidus in uricase-deficient mice: a model for evaluating therapy with poly(ethylene glycol)-modified uricase.J Am Soc Nephrol, 2001,12(5):1001-1009.

[25] Jhonson RJ, Titte S, Cade JR, et al.Uric acid, evolution and primitive cultures.Semin Nephrol, 2005, 25(1):3-8.

[26] Zhang C, Fan K, Zhang W, et al.Structure-based characterization of canine-human chimeric uricases and its evolutionary implications.Biochimie, 2012, 94(6):1412-1420.

[27] Merriman TR, Choi HK, Dalbeth N.The genetic basis of gout.Rheum Dis Clin North Am, 2014, 40(2):279-290.

[28] Krishnan E, Bennett M, Chen L.Aging, not menopause, is associated with higher prevalence of hyperuricemia among older women.Menopause, 2014.[Epub ahead of print]

[29] Will A, Tholouli E.The clinical management of tumour lysis syndrome in haematological malignancies.Br J Haematol, 2011,154(1):3-13.

[30] Seifried RM, Roberts J.Pegloticase for treatment of tophaceous polyarticular gout.Hawaii J Med Public Health, 2013, 72(7):220-223.

[31] Patel S, Le AN.More to rasburicase than uric Acid.Pharmacotherapy,2013, 33(9):e177.

[32] Fan K, Zhang C, Ma XF, et al.Humanized recombinant uricase and mutants thereof: US, 8586535, 2013-11-19.

[33] Gaucher EA.Variants of Ancestral Uricases and Uses Thereof: US,20110268713, 2011-11-03.