大容量人源Fab噬菌體展示抗體庫的構建及抗CD276抗體篩選

劉婕，陳俊亨，徐天殊，王麗萍，趙琦

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大容量人源Fab噬菌體展示抗體庫的構建及抗CD276抗體篩選

劉婕，陳俊亨，徐天殊，王麗萍，趙琦

518055 深圳，中國科學院深圳先進技術研究院抗體藥物研究中心（劉婕、陳俊亨、徐天殊、趙琦）；130012 長春，吉林大學生命科學學院（陳俊亨、徐天殊、王麗萍）

構建大容量人源 Fab 噬菌體庫，篩選并鑒定抗 CD276 的特異性抗體。

通過采集 10 位健康成人的外周血淋巴細胞，提取總 RNA，利用 RT-PCR 擴增人 Fab 抗體基因片段，插入噬菌體載體 pCANTAB5H 中，構建人源 Fab 噬菌體抗體庫。通過固相化的抗原對抗體庫進行 3 輪篩選后，隨機挑取96 個單克隆進行 phage-ELISA 鑒定，篩選出與抗原具有較強結合性的噬菌體克隆。

成功構建庫容為 5 × 1010的噬菌體抗體庫，從中篩選到 11 株陽性克隆，對其進行測序鑒定，表明該 11 株克隆的序列均一致，ELISA 證實其對抗原 CD276 具有較強的結合性。

構建了大容量人源 Fab 抗體庫，從中獲得具有抗 CD276 的人源 Fab 抗體片段，為進一步的研究和應用提供實驗基礎。

免疫球蛋白 Fab 片段； 噬菌體展示抗體庫； CD276

CD276，又叫 B7-H3，是 2001 年在人樹突狀細胞 cDNA 文庫中鑒定出的B7 超家族共信號分子[1]。近年來的研究表明共信號分子不僅能提供T 細胞活化所需的共信號分子促進 T 細胞免疫應答[2]，在抗炎和抗腫瘤免疫應答中發(fā)揮關鍵作用，同時也可以提供下調(diào)免疫應答的負性共信號分子，維持 T 細胞免疫耐受，在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用[3-5]。而 CD276 在正常組織、細胞中不表達或極低表達，高表達于多種腫瘤組織中[6]。本文以 CD276 為靶標，利用噬菌體抗體庫技術克隆出全套人源抗體基因，并在噬菌體表面表達，構建大容量人源 Fab 抗體庫，并從中篩選出特異性抗 CD276 的 Fab 抗體片段，為腫瘤藥物的研制提供新的候選因子。

1 材料與方法

1.1 材料

噬菌體載體 pCANTAB5H 通過對商用載體 pCANTAB5E 進行酶切位點改造獲得[7]；大腸桿菌 TG1 購自美國Lucigen 公司；HB2151 細菌由香港大學張美云教授惠贈；Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶和 T4 DNA 連接酶購自中國NEB 公司；Trizol、DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自德國 Qiagen 公司；RT-PCR 試劑盒購自美國Promega 公司；HRP 標記的鼠抗 Flag 抗體購自美國 Sigma 公司；HRP 標記的鼠抗 M13 抗體和淋巴細胞分離液購自美國 GE Healthcare 公司；CD276 蛋白購自美國R & D 公司；人外周血淋巴細胞來自 10 位健康人捐獻的 2 L 外周血，采用 Ficoll 密度梯度離心分離；所有引物由美國Life Technologies 中國公司合成。

1.2 方法

1.2.1 人外周血淋巴細胞總 RNA 的抽提及 RT-PCR 從采集的 10 個健康人的 2 L 血液分離出淋巴細胞，用 Trizol 試劑提取淋巴細胞總 RNA，按總 RNA 提取試劑盒說明書所述步驟操作。以 Oligo(dT) 為引物反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈 cDNA，具體方法按說明書進行。

1.2.2 重鏈和輕鏈基因的 PCR 擴增 引物設計參考文獻[8]提供的輕鏈及重鏈家族特異性引物序列組合進行 PCR 擴增抗體 VH、λ 和κ片段編碼區(qū)。然后，VH和 CH1 通過重疊 PCR 進行拼接獲得 Fd。再通過重疊 PCR 分別拼接 Fd 和λ 或κ片段，獲得Fab。PCR 的反應條件為：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳純化回收備用。

1.2.3 Fab 噬菌體抗體庫的構建 Fab 基因及 pCANTAB5H 載體質(zhì)粒分別用I 酶切，產(chǎn)物分別回收后進行連接。連接物再經(jīng)脫鹽回收，電轉(zhuǎn)化感受態(tài) TG1 細菌，電轉(zhuǎn)化后迅速加入 2YT 培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng) 1 h，取 100 μl 經(jīng) 10 倍稀釋后鋪 2YT 平板檢測庫容，余下接入 250 ml 的 2YT 液體培養(yǎng)基（含 100 μg/ml 氨芐青霉素、1% 葡萄糖）中，37 ℃培養(yǎng) 6 h，加入輔助噬菌體侵染 1 h，去除培養(yǎng)基，接入 1 L 新 2YT 液體培養(yǎng)基（含 100 μg/ml 氨芐青霉素、50 μg/ml 卡那霉素）中，30 ℃培養(yǎng)過夜。次日從培養(yǎng)液中以 PEG 沉淀噬菌體，加入甘油保存于–80 ℃。

1.2.4 噬菌體抗體庫的篩選 抗體庫篩選參照文獻[9]，將人重組 CD276 用 50 mmol/L 碳酸氫鈉（pH 10.0）包被 ELISA 板，PBS/2% 牛奶封閉后加入噬菌體庫，室溫緩搖 1 h，經(jīng) PBS/0.1% Tween 洗 6 次，酸性洗脫液（0.1 mmol/L HCl-Gly，pH 2.2，0.1% BSA）洗脫結合的噬菌體，再用 1 mol/L Tris-HCl（pH 9.1）中和洗脫液，測滴度，擴增噬菌體用于下一輪篩選。共進行 3 輪篩選，后 2 輪篩選過程同第一輪，但減少包被抗原量，并且逐漸增加 Tween 濃度，分別為 0.3%、0.5%。

單克隆噬菌體的篩選參考文獻[10]，挑取96 株經(jīng) 3 輪篩選獲得的陽性克隆，接種于 100 μl 含 100 mg/L Amp 的 2YT 培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)至600= 0.3 ~ 0.4，加入 25 μl 輔助噬菌體進行侵染，然后加入 25 μl 含300 mg/L Kan 的 2YT 培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)過夜。富集的各個噬菌體克隆采用 ELISA 方法進行特異性鑒定，每孔包被人重組 CD276 100 ng，加 100 μl 噬菌體，HRP 標記的鼠抗 M13 抗體顯色。

1.2.5 Fab抗體的表達和純化 參考文獻[7]，在 HB2151 細菌中可溶性表達 Fab 抗體，0.5 mol/L 的 IPTG 低溫誘導表達過夜，利用滲透壓休克法從細菌周質(zhì)腔獲取可溶性 Fab，鎳柱純化獲得 Fab 蛋白，SDS-PAGE 鑒定純度。

1.2.6 ELISA 分析 純化的 Fab 抗體采用ELISA 方法進行特異性分析，每孔包被人重組 CD276、IGF1R、gp120 和 BSA 各 100 ng，加梯度稀釋的 Fab 抗體，HRP 標記的鼠抗 Flag 抗體顯色。

2 結果

2.1 Fd 段、λ 鏈、κ 鏈的 PCR 擴增及 Fab 組裝

PCR 分別擴增 IgM 重鏈可變區(qū)基因、輕鏈 λ、輕鏈 κ 基因。分別獲得 IgM 和 IgG 的 6 種重鏈可變區(qū)基因，9 種輕鏈 λ 基因，6 種輕鏈 κ 基因，片段大小如圖 1A 所示。重鏈可變區(qū)與 CH1 組建 Fd 片段，最后與輕鏈 λ 或 κ 基因通過重疊 PCR 構建成 1.6 kb 的 Fab 片段（圖 1B）。

bpκ λ IgG IgMVH VH kbκ-Fab λ-Fab 800600 400A 1.61.0 B

Figure 1 PCR amplification of Fd, λ and κ fragments (A) and assembly of Fab fragments by overlapping PCR (B)

2.2 Fab 噬菌體抗體庫的構建

膠純化的 Fab 產(chǎn)物經(jīng)I 酶切、回收純化后與 pCANTAB5H 連接，并電轉(zhuǎn)化至 TG1 菌中，構建 Fab 抗體庫。根據(jù)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在 2YT 平皿上長出的克隆數(shù)，確定其轉(zhuǎn)化子數(shù)為 5 × 1010。將電穿孔轉(zhuǎn)化后的細菌擴大培養(yǎng)，以輔助噬菌體感染，得到含有噬菌體抗體的上清，經(jīng) PEG 沉淀濃縮后獲得噬菌體抗體庫。

2.3 CD276 特異性噬菌體的篩選

進行 3 輪篩選，第一輪篩選采用低篩選強度，獲得所有與抗原結合的噬菌體克隆，目的是除去大部分與抗原無親和力的噬菌體，所獲得的大部分噬菌體結合強度較弱。三輪篩選中，噬菌體經(jīng)過擴增，拷貝數(shù)明顯增加，并且將去污劑 Tween 的濃度逐輪增大（0.1%、0.3%、0.5%），增加沖洗次數(shù)，逐步增加篩選壓力。最終富集的噬菌體的富集指數(shù)提高到 100，說明已經(jīng)成功地富集了與 CD276 具有高親和性的噬菌體（表 1）。

在第三輪篩選富集到的噬菌體中，隨機挑選 96 個噬菌體克隆進行擴增，對其與 CD276 抗原行 ELISA 測定，篩選到 11 個噬菌體克隆顯示出與抗原的高結合性（圖 2）。挑選特異性最好的陽性克隆用于進一步的測序鑒定。

表 1 CD276 篩選的富集效應

注：a：富集指數(shù) =（后一輪 O/I）/（前一輪 O/I）

Note: a: Enrichment factor = (Roundn+1Output/Input)/(RoundnOutput/Input)

OD450

Figure 2 ELISA screening of anti-CD276 phage clones

kD 1 2 3 28 15A

OD4502.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 10 20 30 40 50 抗體濃度（μg/ml）Antibody concentration (μg/ml)B

1：蛋白分子量標準；2~3：抗 CD276 抗體 Fab

1: Protein marker; 2 -3: anti-CD276 Fab

圖 3 抗 CD276 抗體 Fab 的表達純化結果（A）和 ELISA 分析結果（B）

Figure 3 SDS-PAGE (A) and ELISA (B) of purified anti-CD276 Fab against different antigens

2.4 抗 CD276 抗體 Fab 的表達及結合性分析

測序結果顯示所有克隆的序列是相同的，重鏈屬于 V3 家族，輕鏈屬于 VK1 家族。在 HB2151 細菌中可溶性表達 Fab 抗體，經(jīng)鎳離子樹脂純化后，SDS-PAGE 鑒定蛋白的純度可達 95% 以上（圖 3A）。為進一步證實抗體的特異性，CD276 抗原和對照蛋白（IGF1R、gp120 和 BSA）包被 ELISA 板，分析結果顯示 Fab 抗體可以特異性地結合 CD276 抗原，不與其他非相關蛋白結合（圖 3B）。

3 討論

噬菌體抗體庫技術以 PCR 技術和噬菌體展示技術為基礎，通過構建噬菌體抗體庫經(jīng)抗原篩選得到特異性抗體成為獲得人源抗體分子的有效途徑[11]?？贵w庫技術利用抗原即可直接從非免疫抗體庫中得到全人源特異性抗體，并且能篩選到針對該物種自身抗原的抗體，克服了難以用雜交瘤技術的障礙。被廣泛地運用于實驗室研究、疾病的診斷與治療。

從天然抗體庫中成功篩選出相應抗體，關鍵是保證抗體庫中的抗體基因具有足夠數(shù)量及多樣性[12]。本研究收集 10 位健康人外周血分離淋巴細胞，保障抗體基因的全面和多樣性，為成功地構建大庫容量的抗體庫提供了基本的保證。為了盡可能全面地擴增出抗體家族各成員的抗體片段，選擇擴增了所有 IgG 和 IgM 的重鏈家族，盡管在人體內(nèi)輕鏈 λ 鏈的抗體僅占 40%，為了在擴增過程中減少遺漏，同時也擴增了包括 κ 和 λ 在內(nèi)的所有輕鏈成員。從理論上講，F(xiàn)ab 片段的結構與天然抗體的抗原結合部位最為相似，因此選取噬菌體展示的抗體形式。有報道認為天然抗體庫 1010的庫容就可能包容所有的抗體[13]，本研究構建的抗體庫容量為5 × 1010，可以保證得到高特異性的人源抗體。

CD276 是新近發(fā)現(xiàn)的共刺激分子 B7 家族的一個新成員，在 T 細胞介導的免疫反應中起重要的調(diào)節(jié)作用，在正常組織、細胞中不表達或極低表達，高表達于多種腫瘤組織中[6]。以CD276 作為靶抗原，對 Fab 噬菌體抗體庫進行了 3 輪吸附-洗脫-擴增的淘選富集。通過測定各級庫的滴度和洗脫下來的噬菌體的產(chǎn)出率，計算噬菌體抗體庫得到了約 10 倍的富集，表明 CD276 對所構建的噬菌體抗體庫表面呈現(xiàn)抗體的噬菌體起到了淘選富集作用。經(jīng)過 96 孔的單克隆 ELISA 分析和可溶性表達，獲得高純度的 Fab 抗體用于親和性分析。最終鑒定了一個 Fab 抗體可以與 CD276 高親和性結合，這些結果證實從 Fab 噬菌體抗體庫中獲得特異性人源抗體的可行性。

本研究通過提取總 RNA 進行 RT-PCR 等生物學技術初步獲得了一個大容量的人源抗體庫，并且初步篩選得到一個抗腫瘤抗原 CD276 的單克隆抗體，為進一步的研究和應用提供實驗基礎。

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Construction of a large human Fab phage display antibodies library and screening of phage antibodies against CD276

LIU Jie, CHEN Jun-heng, XU Tian-shu, WANG Li-ping, ZHAO Qi

To construct a large human Fab antibodies library and to screen and identify the anti-CD276 phage antibodies from the library.

Total RNA was extracted from peripheral blood lymphocytes of 10 healthy donors, and the Fab antibody genes were amplified by RT-PCR. The amplification products were sequentially cloned into phage vector pCANTAB5E to construct a human Fab phage antibodies library. Antibodies against CD276 were screened using immobilized antigen. After three rounds of screening, 96 randomly selected clones were identified by phage-ELISA to select specific ones with high affinity for CD276.

A large human Fab phage-display library consisting of 5 × 1010members was successfully constructed. From the phage library, we obtained eleven positive clones which had specificity and binding reactivity towards CD276. By sequencing, all of the 11 clones had the same sequences, and their specificity was confirmed by ELISA.

We successfully constructed a large human Fab phage antibodies library and isolated the specific human anti-CD276 Fab antibodies, which provided an experimental foundation in future study and application.

Immunoglobulin Fab fragments; Phage display antibody library; CD276

ZHAO Qi, Email: qi.zhao@siat.ac.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.04.005

諾和諾德-中科院專項研究經(jīng)費（NNCAS-2013-9）

趙琦，Email：qi.zhao@siat.ac.cn

2014-06-13

Author Affiliations: Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen 518055, China (LIU Jie, CHEN Jun-heng, XU Tian-shu, ZHAO Qi); College of Life Science, Jilin University, Changchun 130012, China (CHEN Jun-heng, XU Tian-shu, WANG Li-ping)