抗體在靶向基因治療中的應(yīng)用

王維剛

基因治療是將人的正?；蚧蛴屑膊≈委熥饔玫幕?qū)肴梭w靶細(xì)胞，從而達(dá)到治療目的的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)?；蛑委熣幱诔掷m(xù)發(fā)展的階段，已成為重要的醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)。綜合來說，抗體在基因治療中主要應(yīng)用于兩方面：①直接將抗體基因?qū)塍w內(nèi)，表達(dá)出的蛋白產(chǎn)物作為治療分子發(fā)揮治療作用[1-2]；②作為基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的靶向成分在基因治療中發(fā)揮作用。本文將重點(diǎn)介紹第二方面的研究進(jìn)展。

將編碼治療分子的 DNA，siRNA（small interfering RNA）或反義 RNA（antisense oliognucleotides）高效、準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)入體內(nèi)靶組織和靶細(xì)胞是將基因治療應(yīng)用于臨床的最大技術(shù)障礙?；蜣D(zhuǎn)運(yùn)方式主要有兩種：病毒法[3]和非病毒法?？贵w作為靶向成分在這兩類方法中都起著重要作用。利用逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的方法缺乏組織、細(xì)胞特異性。病毒載體的宿主組織/細(xì)胞嗜向性是由病毒衣殼上的蛋白分子（包膜蛋白）決定的。利用基因工程抗體技術(shù)將包膜蛋白進(jìn)行一些修飾，例如與 scFv 做成嵌合蛋白即可賦予病毒新的結(jié)合特性。納米載體（包括脂質(zhì)體、陽離子多聚體復(fù)合物兩種形式）的應(yīng)用在一定程度上改善了 DNA或 siRNA 的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，但并沒有在實(shí)質(zhì)上解決組織特異性轉(zhuǎn)運(yùn)的問題。因此，一種“靶向納米載體”的概念應(yīng)運(yùn)而生。這一概念涉及到兩類方法。第一類方法主要依靠“細(xì)胞導(dǎo)向配基”（cell targeting ligands，CTLs），比如可以特異性結(jié)合脂蛋白受體、整合素、酪氨酸激酶受體以及 G 蛋白偶聯(lián)受體——GPCR 的短肽和“細(xì)胞穿透肽”（cell penetrating peptides，CPPs），比如以 Tat、antennepedia 為代表的短肽[4]。在第二類方法中，抗體作為轉(zhuǎn)運(yùn)載體的一部分，可以將編碼毒素、治療分子的基因或 siRNA 選擇性地?cái)y帶到靶組織，并將其導(dǎo)入靶細(xì)胞。發(fā)展以抗體為基礎(chǔ)的基因轉(zhuǎn)移，其關(guān)鍵在于抗體-DNA/siRNA 復(fù)合物需要同時(shí)滿足兩個(gè)條件：第一，所用單抗須具有進(jìn)行細(xì)胞導(dǎo)向所必需的抗原結(jié)合特異性；第二，復(fù)合物不僅要易于被靶細(xì)胞內(nèi)吞，而且被攜帶的 DNA/siRNA 需要從內(nèi)涵體中釋放至細(xì)胞質(zhì)中，對(duì)DNA 而言還要進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)有效的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。

1 抗體作為載體攜帶 siRNA

圖1 抗體介導(dǎo) siRNA導(dǎo)向轉(zhuǎn)運(yùn)的兩種策略（A：?jiǎn)捂溈贵w-魚精蛋白-siRNA 復(fù)合物；B：?jiǎn)捂溈贵w靶向的納米脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物）

近年來，siRNA 作為藥物的開發(fā)進(jìn)展迅速，比如針對(duì)年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration,AMD）的 siRNA 治療進(jìn)入了臨床 III 期。特異、高效地將siRNA 導(dǎo)入靶細(xì)胞是臨床治療所面臨的最大挑戰(zhàn)。近年來的一系列研究表明抗體介導(dǎo)的 siRNA 導(dǎo)向治療是可行的。研究者大致采用兩種策略（圖 1）。第一種方法綜合了抗體的特異性和魚精蛋白（protamine，一種小分子堿性蛋白）的核酸結(jié)合屬性。將兩者制成融合蛋白，再與 siRNA 混合形成復(fù)合物，從而實(shí)現(xiàn)特異性的 siRNA 導(dǎo)向。第二種方法又稱納米免疫脂質(zhì)體法，主要涉及兩步驟：首先用抗體對(duì)脂質(zhì)體表面進(jìn)行偶聯(lián)修飾制成免疫脂質(zhì)體，從而賦予其導(dǎo)向性；然后將 siRNA 包裹在上述免疫脂質(zhì)體中。以下將分別討論這兩種策略在 siRNA 導(dǎo)向治療中的應(yīng)用。

2005年，Song 等[5]在 Nature Biotechnology 首次報(bào)道了一項(xiàng)抗體介導(dǎo)的 siRNA 體內(nèi)導(dǎo)向研究。用 Fab 或 scFv抗體片段與魚精蛋白制成融合蛋白，再與 siRNA 混合形成復(fù)合物。該納米復(fù)合物的大小剛好高于腎清除的臨界值（30～50 kD），改進(jìn)了裸 siRNA 半衰期短的缺陷。采用表達(dá) HIV 包膜蛋白的黑色素瘤體內(nèi)模型，將上述復(fù)合物與針對(duì)腫瘤相關(guān)基因的 siRNA（c-myc、MDM2、VEGF）混合并給予荷瘤小鼠，可以將 siRNA 特異性地導(dǎo)入到表達(dá)抗體相應(yīng)抗原的細(xì)胞中，有效抑制腫瘤生長。作者還制成了另一融合蛋白：抗 ErbB2 scFv-魚精蛋白。該融合蛋白可將siRNA 特異性地導(dǎo)入 ErbB2 陽性的乳腺癌腫瘤。Peer 等[6]采用了類似的方法將抗淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1（LFA-1）scFv 與魚精蛋白制成融合蛋白，可以高效、特異地將 siRNA導(dǎo)入原代淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹狀細(xì)胞。體外、體內(nèi)試驗(yàn)證明該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可以特異地抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。

基于類似的思路，一些研究者用抗體進(jìn)行針對(duì)病毒基因的 siRNA 體內(nèi)導(dǎo)向。Wen 等[7]用抗 HBV scFv或 scFv-Fc片段與魚精蛋白融合，該融合蛋白可將 siRNA 或 siRNA表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)的靶細(xì)胞并抑制基因表達(dá)。Kumar 等[8]則嘗試用抗 CD7 scFv 與一段含 9 個(gè)精氨酸的短肽偶聯(lián)，該偶聯(lián)物可將抗病毒 siRNAs 特異地導(dǎo)向小鼠體內(nèi)的幼稚 T 細(xì)胞，從而抑制 HIV 感染。

免疫脂質(zhì)體（immunoliposome）又名抗體-脂質(zhì)體偶聯(lián)物，由抗體和脂質(zhì)體連接而成，是癌癥化療中重要的藥物靶向載體系統(tǒng)，近幾年來已經(jīng)開始用于靶向基因治療。早期用于核酸轉(zhuǎn)移的免疫脂質(zhì)體多采用完整抗體，并著重于方法學(xué)研究。之后以 scFv 片段作為導(dǎo)向載體的研究取得顯著進(jìn)展。2006年以來，Pirollo 研究組[9-10]發(fā)表了一系列采用納米免疫脂質(zhì)體進(jìn)行體內(nèi) siRNA 靶向治療的研究報(bào)道，用抗轉(zhuǎn)鐵蛋白 scFv 制成納米免疫脂質(zhì)體進(jìn)行體內(nèi)抗 HER2 siRNA 導(dǎo)向，可以顯著降低腫瘤細(xì)胞 HER2 基因表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤對(duì)化療的敏感性。為了提高 siRNA 導(dǎo)向效率，對(duì)納米免疫脂質(zhì)體做了一系列改進(jìn)。首先，在該復(fù)合物中加入了一種對(duì)酸堿度敏感的組氨酸/賴氨酸短肽，提高了細(xì)胞內(nèi)化后 siRNA 從內(nèi)涵體的釋放率。其次，采用了比傳統(tǒng)的siRNA 更穩(wěn)定、更高效的 DNA-RNA 雜合雙鏈。Peer 等[11]采用類似思路，將抗 Cyclin D1 siRNA 系統(tǒng)地導(dǎo)入體內(nèi)特定白細(xì)胞亞群，其靶向轉(zhuǎn)運(yùn)是通過抗 β7 整合蛋白完整單抗來實(shí)現(xiàn)的。Zhang 等[12]則采用了一種略微不同的策略將siRNA 質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠腦組織治療腦癌。他們選擇 EGFR 作為 siRNA 靶點(diǎn)，并用兩種單抗對(duì)聚乙二醇化的脂質(zhì)體表面進(jìn)行修飾：抗鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白單抗使免疫脂質(zhì)體得以穿過血腦屏障；抗人胰島素受體單抗可以使免疫脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物特異地結(jié)合腦瘤細(xì)胞表面受體并引發(fā)內(nèi)化。結(jié)果表明靜脈注射該免疫脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物可明顯降低腦瘤 EGFR 表達(dá)水平，顯著延長荷瘤小鼠存活時(shí)間（88%）。

Avidin-Biotin 是一項(xiàng)穩(wěn)定、可靠的蛋白連接技術(shù)，近年也有多篇報(bào)道嘗試將其用于 siRNA 的抗體導(dǎo)向治療[13-14]。將 siRNA 3' 末端生物素化，再與單抗-親和素（抗生物素蛋白）偶聯(lián)物混合，即可制成穩(wěn)定的單抗-siRNA 復(fù)合物。靜脈注射該抗轉(zhuǎn)鐵蛋白單抗-siRNA 復(fù)合物可以有效降低小鼠腦內(nèi)細(xì)胞中靶基因的表達(dá)（抑制率 69%～81%）。

2 抗體作為載體攜帶毒素或其他治療基因

抗體用于基因治療靶向載體的嘗試，實(shí)際上最早是由攜帶編碼治療分子的基因開始的?；蛑委熕幬锏慕o藥途徑有兩種：即 in vivo 及 ex vivo 方式。

2.1 In vivo 途徑

這種途徑是指將外源基因裝配于真核細(xì)胞表達(dá)載體中，直接導(dǎo)入體內(nèi)?？贵w作為載體攜帶毒素基因或其他治療基因大體也是基于以下兩種方法。第一，利用抗體與某些正電荷短肽的融合/偶聯(lián)蛋白；第二，納米免疫脂質(zhì)體法。

除了魚精蛋白以外，研究者也嘗試?yán)闷渌姾啥屉慕Y(jié)合抗體進(jìn)行基因?qū)颍瑧?yīng)用較多的是聚乙烯亞胺（PEI）。用化學(xué)方法將單抗或單抗片段與 PEI 偶聯(lián)，再與 DNA 混合即可制成納米顆粒。一系列抗體，包括抗 G250、Hsp70、HER2、CD3、CD90、EGFR 的單抗或 scFv 與 PEI 偶聯(lián)物可以將 DNA 表達(dá)載體高效、特異地導(dǎo)入到表達(dá)相應(yīng)抗原的靶細(xì)胞中[15-20]。

大多數(shù)免疫脂質(zhì)體導(dǎo)向基因轉(zhuǎn)運(yùn)研究均停留于體外方法學(xué)研究階段。值得注意的是，Chang 研究組在小鼠體內(nèi)進(jìn)行了一系列納米免疫脂質(zhì)體導(dǎo)向基因治療研究。用抗轉(zhuǎn)鐵蛋白 scFv 制成納米免疫脂質(zhì)體攜帶 p53 表達(dá)載體[21]，該納米免疫脂質(zhì)體-p53 復(fù)合物可以將 p53 基因有效地轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞并表達(dá)。聯(lián)合給予該復(fù)合物和化療藥可以顯著延長荷瘤鼠存活時(shí)間。Pirollo 等[22]用上述免疫脂質(zhì)體進(jìn)行體內(nèi)RB94 導(dǎo)向基因轉(zhuǎn)運(yùn)，結(jié)果表明該免疫脂質(zhì)體可以將 RB94基因定向轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞和組織，顯著增強(qiáng)腫瘤對(duì)化療藥的敏感性。

除上述兩種主流方法外，利用 Biotin-Avidin 技術(shù)[23]或化學(xué)法[24]直接連接抗體和 DNA 載體進(jìn)行導(dǎo)向基因轉(zhuǎn)移的研究亦有報(bào)道。

2.2 Ex vivo 途徑

這是指將含外源基因的載體在體外導(dǎo)入自身或異體細(xì)胞（或異種細(xì)胞），經(jīng)體外擴(kuò)增后，再將細(xì)胞輸回人體。Ex vivo 基因轉(zhuǎn)移途徑比較經(jīng)典、安全，但是步驟多、技術(shù)相對(duì)復(fù)雜。

Chen 等[25]在 1997年首次報(bào)道了轉(zhuǎn)染后的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以長期產(chǎn)生和分泌免疫毒素。他們建立了一種特異性針對(duì)腫瘤或 HIV-1 感染細(xì)胞的新型殺傷細(xì)胞，該細(xì)胞顯著抑制荷瘤裸鼠腫瘤生長，延長動(dòng)物存活期。之后，Yang研究組陸續(xù)進(jìn)行了一系列抗體導(dǎo)向的免疫促凋亡蛋白（immunoproapoptotic proteins）對(duì)腫瘤的殺傷作用研究[26]。他們選擇在乳腺癌、卵巢癌及胃癌中呈現(xiàn)過度表達(dá)的 HER2作為靶標(biāo)。克隆改造人促凋亡分子 caspas-3、caspas-6、Granzyme B、AIF 和 BID 等基因，將其與銅綠假單胞菌外毒素 A（PEA）轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域基因和抗 HER2 抗體的基因重組，構(gòu)建成靶向促凋亡分子基因（圖 2）。理論上，用該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，抗體-促凋亡蛋白表達(dá)后被分泌出細(xì)胞外，選擇性地與 HER2 陽性的靶腫瘤細(xì)胞結(jié)合并內(nèi)化，促凋亡蛋白繼而在內(nèi)涵體中被前蛋白轉(zhuǎn)換酶 Furin 或其他蛋白酶剪切后釋放到靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究者用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人淋巴瘤 Jurkat 細(xì)胞并建成能穩(wěn)定表達(dá)、分泌抗體-促凋亡蛋白的細(xì)胞系，再將該細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增，并靜脈注射荷瘤裸鼠。結(jié)果表明，該細(xì)胞產(chǎn)生的促凋亡蛋白特異性地分布在腫瘤組織，對(duì) HER2 陽性的乳腺癌、胃癌、肝癌、骨肉瘤、卵巢癌細(xì)胞具有高效的殺傷作用。荷瘤裸鼠腫瘤生長受到抑制，存活期顯著延長。進(jìn)而對(duì)免疫促凋亡分子中的 PEA 轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域部分進(jìn)行改造并引入了前蛋白轉(zhuǎn)換酶 Furin 蛋白酶切割位點(diǎn)序列，結(jié)果證實(shí)這種轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域替換后的靶向促凋亡分子仍能從內(nèi)吞體轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)，并有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。

圖2 抗體導(dǎo)向的免疫促凋亡蛋白

3 結(jié)語

與早期抗體藥物的發(fā)展過程相仿，基因治療正處于一個(gè)緩慢但持續(xù)進(jìn)步的階段。以抗體為基礎(chǔ)的基因治療為疾病的治療提供了新思路，可以作為手術(shù)、化療、放療等傳統(tǒng)治療方案的輔助措施?？贵w或抗體片段可以直接作為治療分子在體內(nèi)表達(dá)，發(fā)揮對(duì)疾病的治療作用，也可以間接作為基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的靶向成分。盡管還有許多需要解決的技術(shù)問題，但值得強(qiáng)調(diào)的是，抗體為基礎(chǔ)的基因治療所面臨的大部分問題也是其他治療方法的共同問題。任何相關(guān)領(lǐng)域的重大突破也必將極大推動(dòng)以抗體為基礎(chǔ)的基因治療的發(fā)展。

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