抗人甲胎蛋白單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA檢測技術(shù)的建立

孫一帆，楊全利，黃建芳，趙鳳芝，向軍儉

?

抗人甲胎蛋白單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA檢測技術(shù)的建立

孫一帆，楊全利，黃建芳，趙鳳芝，向軍儉

510632 廣州，廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室/暨南大學抗體工程研究中心

制備、篩選多株具有商用價值的可配對的高特異性、高親和力的抗人甲胎蛋白（hAFP）單克隆抗體，初步建立雙抗體夾心 ELISA 檢測方法。

通過經(jīng)典的淋巴細胞雜交瘤技術(shù)篩選分泌抗 hAFP 單抗的雜交瘤細胞株；對篩選所得單抗的特性進行鑒定分析；雙抗體夾心 ELISA 法篩選最佳配對抗體；初步建立 DAS-ELISA 檢測方法并檢測血樣，繪制其標準檢測曲線并與進口試劑盒比較。

共獲得 12 株穩(wěn)定分泌抗 hAFP 單抗的雜交瘤細胞株，其中 Ab 1 ~ Ab 5 5 株單抗的腹水效價均高于 600 萬，Ab 5 的效價高達 3000 萬；特異性鑒定結(jié)果表明 Ab 1 ~ Ab 5 均能夠特異識別天然 hAFP 分子，但 Ab 5 與人血清白蛋白（HSA）存在較強交叉反應(yīng)；抗體配對實驗共篩選出 5 對（Ab 1/HRP-Ab 2、Ab 1/HRP-Ab 4、Ab 3/HRP-Ab 2、Ab 3/HRP-Ab 4 和 Ab 4/HRP-Ab 1）能夠滿足 hAFP 檢測要求且無交叉反應(yīng)的配對抗體，最終確定 Ab 1 + Ab 3/ HRP-Ab 2 和 Ab 1 + Ab 3/HRP-Ab 4 為最佳配對組合；利用最佳配對抗體組合建立標準檢測曲線，其線性檢測范圍為 5 ~ 250 ng/ml，最低檢測限 2 ng/ml，檢測上限 400 ng/ml，優(yōu)于進口試劑盒的線性范圍 5 ~ 200 ng/ml 和最低檢測限 5 ng/ml；樣檢結(jié)果顯示自制試劑盒的陽性血清檢測準確率 99.2%（119/120 例），陰性血清準確率 100%（40/40 例）。

篩選獲得的 4 株高親和力、高特異性抗 hAFP 單抗均可應(yīng)用于 DAS-ELISA 試劑盒的研制，Ab 1和 Ab 3 適合作為捕獲抗體，Ab 2 和 Ab 4 適合作檢測抗體；自制試劑盒的線性檢測范圍和最低檢測限均優(yōu)于進口試劑盒，表明具有商用價值。

甲胎蛋白類； 抗體，單克??； 雙抗體夾心ELISA

人甲胎蛋白（human alpha fetoprotein，hAFP）是一種由胎兒肝細胞和卵黃囊合成出的胚胎性糖蛋白，其功能與人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）相似，可視其為胎兒發(fā)育時期的 HSA替代物[1-2]。正常情況下，hAFP 僅存在于胎兒血清中，胎兒出生一年后 hAFP 濃度降回正常人水平（< 5 ng/ml），正常人血清中的濃度一般不高于20 ng/ml。當身體發(fā)生原發(fā)性肝癌時，肝癌細胞可大量分泌 hAFP 于外周血中，引發(fā)血液 hAFP 濃度的異常升高。

hAFP 是最早發(fā)現(xiàn)的腫瘤標志物之一，其長期以來被作為肝癌、胎兒缺陷以及胚胎相關(guān)癌的重要血清分子標記物，是血液檢驗中的重要評價指標分子[3-4]。除應(yīng)用于產(chǎn)前診斷和肝細胞癌診斷外，hAFP 的血液檢測對肝損傷、肝硬化、肝炎、腸胃癌、神經(jīng)管損傷、內(nèi)胚竇瘤、生殖系統(tǒng)癌癥等疾病的診斷及病情監(jiān)控也具有重要意義[5-6]。

中國是個人口大國，產(chǎn)前診斷與每個家庭都息息相關(guān)；同時，中國又是一個肝癌高發(fā)地區(qū)，每年死于肝癌的人數(shù)占全世界死亡人數(shù)的40% 以上[7]，由于中晚期肝癌基本無有效治療方法，所以對原發(fā)性肝癌特異性腫瘤抗原 hAFP 血液濃度的全民普查和早期診斷是解決肝癌高死亡率的最有效措施[8]。因此，靈敏、特異、準確、簡便、低成本的血清 hAFP 檢測方法的建立迎合了社會的迫切需要。

本研究通過制備多株特異性、高親和力的抗 hAFP 單克隆抗體，從中篩選出具有商用價值的配對抗體，為研制雙抗體夾心 ELISA（DAS-ELISA）試劑盒奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

6 周齡 SPF 級雌性 BALB/c 小鼠購自南方醫(yī)科大學動物中心；hAFP 和 HSA 購自美國Fitzgerald 公司；患者血清取自廣州華僑醫(yī)院；標準抗體（AFP-01、AFP-11）和進口 DAS-ELISA 試劑盒均購自英國ABCam 公司。

1.2 方法

1.2.1 抗 hAFP 單克隆抗體的制備 免疫BALB/c 小鼠，通過常規(guī)的細胞融合方法和有限稀釋法克隆化，篩選能夠穩(wěn)定分泌抗 hAFP 單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并制備其腹水型單抗。

1.2.2 單抗的特性鑒定 用間接 ELISA 法分別測定篩選所得單抗的 IgG 亞類、腹水效價及與HSA 的交叉反應(yīng)。利用篩選所得的 5 株高親和力單抗，對 HepG2 人肝癌細胞進行免疫熒光染色（FITC 和 DAPI 雙染，400 倍顯微鏡下觀察），以鑒定單抗與天然 hAFP 分子特異性結(jié)合的能力。

1.2.3 雙抗體夾心法配對實驗 HRP 標記單抗后，使用 DAS-ELISA 棋盤法篩選配對抗體對。以400 ng/ml 的 hAFP 作為檢測原，4 mg/ml 的 HSA 作為交叉反應(yīng)對照，PBS 作空白對照。

1.2.4 雙抗體夾心 ELISA 法的建立 以 Ab 1 和 Ab 3 為捕獲抗體，以 HRP-Ab 2 或 HRP-Ab 4為檢測抗體，建立 DAS-ELISA 檢測方法。經(jīng)檢測條件優(yōu)化，繪制其標準檢測曲線，并與進口試劑盒的標準曲線比較。

1.2.5 樣品檢測 使用已優(yōu)化的自制雙抗體夾心試劑盒（Ab 1 + Ab 3/HRP-Ab 2）檢測血清樣品，并與醫(yī)院檢測結(jié)果和 ABCam 雙抗體夾心檢測試劑盒的檢測結(jié)果比較。

2 結(jié)果

2.1 單克隆抗體的制備與特性鑒定

共篩選得到 12 株能夠穩(wěn)定分泌抗 hAFP 單抗的雜交瘤細胞株，其特性鑒定結(jié)果如表 1 所示。Ab 1 ~ Ab 8 的單抗亞類均為IgG1 型，Ab 9 ~Ab 12 為 IgG2 型。Ab 1、Ab 2、Ab 3、Ab 5 均具有較高腹水效價且明顯高于其他細胞株，其中Ab 5 的腹水效價最高，滴度為 1:3 × 107，Ab 1~ Ab 3 的腹水滴度為 1:6.5 × 106~ 1:9 × 106；Ab 4 的細胞株不能產(chǎn)生腹水，但其細胞上清也具有較高效價，滴度達 1:16 000。通過間接 ELISA 測定單抗與高濃度交叉反應(yīng)原 HSA 的交叉反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn) Ab 2、Ab 3、Ab 4、Ab 10 和 Ab 12 具有很好的 hAFP 特異性，無交叉反應(yīng)；Ab 1 和 Ab 6 在效價稀釋倍數(shù)時與 HSA 有輕微交叉反應(yīng)，Ab 5、Ab 7、Ab 8 和 Ab 9 的交叉反應(yīng)較強。

結(jié)果表明，Ab 1 ~ Ab 4 這 4 株單抗具有親和力高、特異性好的特性，Ab 5 的特異性較差，但效價極高，提示其可能具有極高親和力。

2.2 單抗特異性鑒定

為驗證篩選所得單抗是否能夠與天然存在的 hAFP 分子特異性結(jié)合，使用 Ab 1 ~ Ab 5 這 5 株高親和力單抗進行了 HepG2 人肝癌細胞免疫熒光染色，無關(guān)單抗作陰性對照組。結(jié)果顯示，在 5 株單抗對應(yīng)的實驗組中，HepG2 細胞內(nèi)均呈現(xiàn)明顯綠色熒光，而無關(guān)抗體對照組細胞未觀察到綠色熒光，說明 Ab 1 ~ Ab 5 單抗特異性識別了人肝癌細胞胞漿內(nèi)的 hAFP 分子，證明該 5 株單抗均能夠特異識別天然產(chǎn)生的人源 AFP 分子（圖 1）。

表 1 單抗的特性鑒定

注：“–”表示與HSA 無交叉反應(yīng)；“+”表示與HSA 有交叉反應(yīng)，“+”數(shù)量越多表示交叉反應(yīng)越強。

Notes: “-”indicates no cross-reaction with HSA; “+” indicates a cross-reaction with HSA, more “+” indicates stronger cross reaction.

圖 1 HepG2 細胞的免疫熒光染色（400 ×）

Figure 1 Immunofluorescence staining of the HepG2 cells

2.3 DAS-ELISA 棋盤法配對實驗

純化并用 HRP 標記 7 株親和力較高的單抗（Ab 1、Ab 2、Ab 3、Ab 4、Ab 5、Ab 6、Ab 10），以用于抗體配對實驗。配對結(jié)果顯示（表 2），在 49（7 × 7）種抗體配對組合中，有 13 種組合可形成雙抗體夾心配對，其中，與 HSA 完全無交叉反應(yīng)且具有較好配對效果的共有 5 種組合：Ab 1/ HRP-Ab 2、Ab 1/HRP-Ab 4、Ab 3/HRP-Ab 2、Ab 3/ HRP-Ab 4和 Ab 4/HRP-Ab 1。

表 2 雙抗體夾心法篩選配對抗體

注：“+”數(shù)量代表450值的高低：“+”> 1.0，“++”> 2.0，“+++”> 3.0；“–”代表450值< 0.5；紅色“+”代表無交叉反應(yīng)，“+*”代表有或略有交叉。

Notes: The quantity of “+” indicates the valve of450: “+” > 1.0, “++” > 2.0, “+++” > 3.0; “–”< 0.5; The red “+” indicates no cross-reaction, “+*” indicates a cross-reaction with HSA was observed.

2.4 DAS-ELISA 檢測方法的建立及比較

通過一系列檢測方法優(yōu)化，最終確定以 Ab 1 + Ab 3/HRP-Ab 2 和 Ab 1 + Ab 3/HRP-Ab 4 為最佳配對組合建立 DAS-ELISA 檢測方法，兩組配對組合的檢測范圍及靈敏度相同，建立其標準檢測曲線，并與進口試劑盒的標準曲線比較。

結(jié)果顯示，自制 DAS-ELISA 檢測方法與進口試劑盒的完整檢測曲線非常相近，檢測范圍和檢測靈敏度大致相同；但自制 DAS-ELISA 檢測方法在 hAFP 濃度 0 ~ 300 ng/ml 范圍內(nèi)的線性檢測曲線優(yōu)于進口試劑盒，進口試劑盒的線性標準曲線頂部彎曲程度較大（圖 2）。

雖然進口試劑盒說明書中指出該試劑盒的線性檢測范圍為 2 ~ 300 ng/ml，但實際測得的線性范圍只有 5 ~ 200 ng/ml，檢測下限 5 ng/ml；而自建檢測方法的線性檢測范圍為 5 ~ 250 ng/ml，檢測下限 2 ng/ml，檢測上限 400 ng/ml，略優(yōu)于進口產(chǎn)品。

2.5 樣品檢測

共收集了 hAFP 陽性患者血清 120 例（孕婦118 例，原發(fā)性肝癌 2 例），陰性正常人血清40 例，分別用自建的 DAS-ELISA 檢測方法和進口試劑盒檢測血樣，并統(tǒng)計樣檢準確率。結(jié)果顯示，兩試劑盒均能有效檢測人血清中 AFP 的濃度。其中，進口試劑盒對陰、陽性血清樣品的檢測準確率均為100%，檢測穩(wěn)定、準確；自建的檢測方法在對120 份陽性血清檢測時檢出 1 例陰性，準確率 99.2%，在對 40 份陰性血清檢測時，準確率 100%，同樣得出較準確結(jié)果（表 3）。證明該初步建立的 DAS-ELISA 試劑盒檢測方法能夠應(yīng)用于實際血清樣品的檢測。

OD4503.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 OD4503.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 1 10 100 1000 100 200 300 400 自制 AFP 標準溶液（ng/ml）Self-made standard AFP solutions（ng/ml）A 試劑盒 AFP 標準溶液（ng/ml）Standard AFP solutions from the kit（ng/ml）B

Figure 2 Comparison between hAFP ELISA kit (ABCam) and the homemade one (A: Standard curves ; B: Linear standard curves)

表 3 樣品檢測結(jié)果

3 討論

自 1975 年淋巴細胞雜交瘤技術(shù)誕生以來，單抗制備技術(shù)迅猛發(fā)展，開啟了檢測試劑盒研發(fā)和靶向治療的新時代，成為了現(xiàn)代科技轉(zhuǎn)化為實際應(yīng)用的最重要代表之一[9]。人甲胎蛋白作為原發(fā)性肝癌最特異的腫瘤標志物和產(chǎn)前診斷檢測分子，其單克隆抗體具有極其重要的實際應(yīng)用意義。雖然國內(nèi)外均已成功制備了抗 hAFP 單抗并應(yīng)用于試劑盒生產(chǎn)[10-11]，但不斷開發(fā)具有更高靈敏度、更好線性檢測范圍的雙抗體夾心配對抗體仍是試劑盒研發(fā)的努力方向，也是臨床檢測的需要。

目前，血清 hAFP 的檢測方法主要是雙抗體夾心 ELISA 試劑盒法，該方法對其使用的配對抗體具有較高要求，兩個配對抗體不僅需要高特異性、高親和力，還需要具有穩(wěn)定的抗原結(jié)合活性，其對應(yīng)抗原結(jié)合位點之間的空間位置關(guān)系也同樣直接影響該抗體對的檢測靈敏度和檢測范圍。本研究從制備所得的 12 株抗 hAFP 單克隆抗體中成功篩選出 5 對有應(yīng)用價值的配對抗體，并最終建立了以 Ab 1 + Ab 3 為捕獲抗體、Ab 2 或 Ab 4 為檢測抗體的 DAS-ELISA 檢測方法，其線性檢測范圍為 5 ~ 250 ng/ml，檢測下限 2 ng/ml，均優(yōu)于 ABCam 進口試劑盒，且血樣檢測結(jié)果顯示其具有很好的檢測準確度，表明該初步建立的 DAS-ELISA 檢測方法具有較好的臨床應(yīng)用價值。

[1] Mizejewski GJ. New insights into AFP structure and function: potential biomedical applications. Orlando: Academic Press, 1985: 5-34.

[2] Deutsch HF. Chemistry and biology of alpha-fetoprotein. Adv Cancer Res, 1991, 56:253-312.

[3] Tatarinov YS. Content of embryo-specific alpha-globulin in the blood serum of the human fetus, newborn, and adult man in primary cancer of the liver. Vop Khim SSR, 1965, 11:20-24.

[4] Brock DJ, Sutcliffe RG. Alpha-fetoprotein in the antenatal diagnosis of anencephaly and spina bifida. Lancet, 1972, 2(7770):197-199.

[5] Mizejewski GJ. Levels of alpha-fetoprotein during pregnancy and early infancy in normal and disease states. Obstet Gynecol Surv, 2003, 58(12):804-826.

[6] Mizejewski GJ. Biological role of alpha-fetoprotein in cancer: prospects for anticancer therapy. Expert Rev Anticancer Ther, 2002, 2(6):709-735.

[7] Tang ZQ. Progress in clinical research of liver cancer and the prospects of 21st century. ACAT Academiae Med Shanghai, 1997, 24(3):323-326. (in Chinese)

湯釗猷. 肝癌臨床研究的進展與21世紀的展望. 上海醫(yī)科大學學報, 1997, 24(3):323-326.

[8] Bruix J, Llovet JM. Prognostic prediction and treatment strategy in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2002, 35(3):519-524.

[9] Kong J, Liu Q, Han YW, et al. The advances and application prospects of monoclonal antibody preparation technology. Immunol J, 2011, 27(2):170-173. (in Chinese)

孔君, 劉箐, 韓躍武, 等. 單克隆抗體制備技術(shù)的最新進展及應(yīng)用前景. 免疫學雜志, 2011, 27(2):170-173.

[10] Porstmann B, Avrameas S, Ternynck T, et al. An antibody chimera technique applied to enzyme immunoassay for human alpha-1- fetoprotein with monoclonal and polyclonal antibodies. J Immunol Methods, 1984, 66(1):179-185.

[11] Han Y, Li L, Zhang PY, et al. Preparation of monoclonal antibody against alpha fetoprotein and its nature research. Norman Bethune Med Univ J, 1984, 10(8):237-241. (in Chinese)

翰儀, 李俐, 張培因, 等. 抗甲胎蛋白單克隆抗體的制備及其性質(zhì)的研究. 白求恩醫(yī)科大學學報, 1984, 10(8):237-241.

Preparation of monoclonal antibodies against hAFP and development of mAb-based sandwich ELISA

SUN Yi-fan, YANG Quan-li, HUANG Jian-fang, ZHAO Feng-zhi, XIANG Jun-jian

To prepare several hAFP-specific monoclonal antibodies with high specificity and high affinity. To screen antibody pairs with potential commercial value from these mAbs and to develop a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (DAS-ELISA) for the detection of hAFP.

mAbs were prepared using the classic hybridoma fusion method, and the specificity of mAb was identified and analyzed. Using DAS-ELISA, the best antibody pair was selected from the mAbs. DAS-ELISA was optimized and compared to an ABCam ELISA kit. Then the initially self-made kit was used to detect a total of 160 samples (including 120 positive and 40 negative serums).

A total of 12 mAbs was prepared and 5 of them had very high affinities. The titers of ascites of both Ab 1 - Ab 5 were less than 1: 6 million and Ab 5 had the best titer: 1:30 million. Both Ab 1 - Ab 5 could recognize the natural hAFP specifically, but Ab 5 had cross-reaction with HSA. In the selected antibody pairs, Ab 1/HRP-Ab 2, Ab 1/HRP-Ab 4, Ab 3/HRP-Ab 2, Ab 3/HRP-Ab 4 and Ab 4/HRP-Ab 1 were identified to be capable of application. Ab 1 + Ab 3/HRP-Ab 2 and Ab 1 + Ab 3/HRP-Ab 4 were identified as the best antibody pairs to establish the DAS-ELISA kit. The self-made kit had better linear scale of detection (5 - 250 ng/ml) than that of ABCam kit (5 - 200 ng/ml), and better limitation of detection (2 ng/ml) than that of ABCam (5 ng/ml). The self-made kit also showed good results in detecting the samples with accuracies of 99.2% (119/120) in positive serums and 100% (40/40) in negative serums.

4 mAbs ( including capture mAbs Ab 1 and Ab 3 and detection mAbs Ab 2 and Ab 4) with high affinity and specificity are used in developing the DAS-ELISA kit. The better linear scale and limitation of detection also suggest that this kit would have good commercial value.

Alpha-fetoproteins; Antibodies, monoclonal; Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay

XIANG Jun-jian, Email: txjj@jnu.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.04.004

廣東省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)核心技術(shù)攻關(guān)項目“免疫熒光定量快速檢測技術(shù)在重大疾病檢測中的應(yīng)用”（2012A080800007）

向軍儉，Email：txjj@jnu.edu.cn

2014-06-09

Author Affiliation: Guangdong Province Key Laboratory of Molecular Immunology and Antibody Engineering/ Research Center for Antibody Engineering, Jinan University,Guangzhou 510632, China