基于TNF功能表位設(shè)計(jì)新型人源單鏈抗體

常宏，呂明，喬春霞，李新穎，耿晶，周婷婷，林周，沈倍奮，馮健男

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基于TNF功能表位設(shè)計(jì)新型人源單鏈抗體

常宏，呂明，喬春霞，李新穎，耿晶，周婷婷，林周，沈倍奮，馮健男

100850 北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所（常宏、呂明、喬春霞、李新穎、耿晶、周婷婷、林周、沈倍奮、馮健男）；050200 石家莊，河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（常宏）

開(kāi)發(fā)基于 TNF 功能表位的新型人源單鏈抗體。

利用自主研制的鼠抗 TNF-α 中和單抗 Z12 能特異性識(shí)別 TNF-α 的 141 ~ 146 位功能表位特性，通過(guò)理論模擬構(gòu)建 TNF/抗體 Z12 相互作用的復(fù)合物模型設(shè)計(jì)獲得功能性拮抗肽（PT2、PT3、PT4、PT7）以及單域抗體 PTVH5（以人抗體可變區(qū)重鏈框架 VH5 為支架合理展示 PT2、PT3、PT4），利用計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)以及同源模建、分子對(duì)接方法，進(jìn)一步合理選擇人抗體可變區(qū)輕鏈框架（Vκ1）作為展示支架，通過(guò)構(gòu)象判別、作用能比較以及識(shí)別區(qū)域確認(rèn)并選擇合適的連接肽設(shè)計(jì)新型單鏈分子ScFv_AB1。

理論分析發(fā)現(xiàn)，ScFv_AB1 穩(wěn)定性較好，識(shí)別 TNF-α 的 141 ~ 146 功能位點(diǎn)（即 Z12 識(shí)別的位點(diǎn)）。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，ScFv_AB1 能與 TNF-α 結(jié)合、抑制 TNF-α 與 TNFR 的結(jié)合、抑制TNF-α 介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。

初步驗(yàn)證了“借助計(jì)算機(jī)模建，基于人抗體可變區(qū)的框架結(jié)構(gòu)和拮抗肽設(shè)計(jì)單鏈抗體分子”的策略是可行的，從而為人源小分子抗體的制備提供了一條可供選擇的途徑。

腫瘤壞死因子α； 單鏈抗體； 計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)； 支架； 同源模建； 拮抗肽

腫瘤壞死因子 α（TNF-α）是一種多功能的細(xì)胞因子，主要由激活的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞分泌，其他如中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞在一定條件下也能產(chǎn)生[1-3]。成熟的 TNF-α（17 kD）由膜型 TNF-α（26 kD）切割而產(chǎn)生，兩種形式的 TNF-α 都具有生物活性[4]。TNF-α 有3 個(gè)與受體結(jié)合的主要活性表位，即 29 ~ 36、84 ~ 91 和 141 ~ 146 位。TNF-α 以活性三聚體的形式與細(xì)胞表面的 TNF-α 受體（TNFR）結(jié)合，從而啟動(dòng)信號(hào)通路，發(fā)揮生物學(xué)功能[5-8]。

TNF-α 的過(guò)表達(dá)與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）、克羅恩病、多發(fā)性硬化癥等自身免疫性疾病的密切關(guān)系已得到證實(shí)[9-11]。TNF-α 還是一個(gè)重要的前炎性細(xì)胞因子，可以介導(dǎo)多種炎性因子的釋放，如 IL-1、IL-6、GM-CSF[12]。越來(lái)越多的疾病被發(fā)現(xiàn)與 TNF-α 的過(guò)量分泌有關(guān)，TNF-α 已經(jīng)成為治療這類(lèi)疾病的一個(gè)有效靶標(biāo)[13-15]。

目前，已被 FDA 批準(zhǔn)的 TNF-α 拮抗劑有：依那西普（商品名：恩利）是 TNFRII-Fc 融合蛋白；Remicade（infliximab）是一種人-鼠嵌合單抗；Humira（adalimumab）是利用抗體庫(kù)技術(shù)篩選得到的人源單抗，它們主要用于 RA 和結(jié)腸克羅恩病的治療[15-16]。

課題組在 TNF-α 中和抗體制備、TNF-α 拮抗分子設(shè)計(jì)方面已取得了一定進(jìn)展：確定了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的鼠源中和抗體 Z12 識(shí)別的 TNF-α 的功能表位（141 ~ 146 位氨基酸殘基）[17]；根據(jù)TNF/抗體相互作用的立體結(jié)構(gòu)信息，設(shè)計(jì)了一系列具有中和活性的拮抗肽（PT2、PT3、PT4、PT7）[18-19]；為提高拮抗肽的穩(wěn)定性和活性，將拮抗肽 PT4 與人 IgG1 的 Fc 段連接構(gòu)建 PT4-Fc 融合蛋白[20]；嘗試?yán)萌丝贵w可變區(qū)的重鏈 VH5 框架來(lái)展示 TNF-α 拮抗肽（PT2、PT3、PT4），設(shè)計(jì)得到人源單域抗體 PTVH5[21]。結(jié)果顯示，與單獨(dú)的拮抗肽相比，新構(gòu)建的 PT4-Fc 或 PTVH5 的穩(wěn)定性增強(qiáng)，生物學(xué)活性明顯提高，而且抗體可變區(qū)框架比 Fc 段更適于展示拮抗肽。

抗體可變區(qū)框架的應(yīng)用價(jià)值已被抗體庫(kù)的蓬勃發(fā)展充分證實(shí)[22-24]，盡管所設(shè)計(jì)的拮抗分子的活性還不能令人滿(mǎn)意，但已證明這是一條比較合理的設(shè)計(jì)拮抗分子的途徑，它促使我們進(jìn)一步去開(kāi)發(fā)活性更好的拮抗分子。

分析認(rèn)為，在單域抗體 PTVH5 的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)單鏈抗體，可能會(huì)獲得活性更好的拮抗分子。理論上講，隨著 VL的加入，其 LCDR3 與 HCDR3 能形成較強(qiáng)的疏水口袋，通過(guò)“鎖-鑰匙”結(jié)構(gòu)與抗原表位緊密結(jié)合，加上其他重、輕鏈 CDR 區(qū)的作用，有利于抗原-抗體復(fù)合物的形成，也更符合天然抗體識(shí)別抗原的模式；同時(shí)，與單域抗體相比，單鏈抗體的半衰期將大大延長(zhǎng)?；诖耍菊撐囊罁?jù)已有的拮抗肽（PT2、PT3、PT4、PT7）以及人抗體可變區(qū)基因聚類(lèi)分析結(jié)果（七類(lèi) VH，七類(lèi) VL），嘗試?yán)萌丝贵w重、輕鏈可變區(qū)框架合理展示拮抗肽，設(shè)計(jì)人源單鏈抗體構(gòu)象庫(kù)；借助 TNF/抗體相互作用的立體結(jié)構(gòu)信息，合理設(shè)計(jì)、篩選新型 TNF 拮抗分子。

1 材料與方法

1.1 材料

計(jì)算機(jī)模建所用硬件為美國(guó) Silicon Graphics Inc.（SGI）圖形工作站、IBM 工作站。軟件為Insight II（2005）程序包。

pET22b(+) 質(zhì)粒、表達(dá)菌株 BL21（DE3，基因型為 F-ompT hsdSB r-m-gal dcm）由本研究室保存；限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自美國(guó) NEB 公司；T4 DNA 連接酶購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；高保真 Taq 酶（pyrobest）購(gòu)自日本 Takara 公司；螯合 Ni2+的瓊脂糖凝膠層析柱購(gòu)自北京本元正陽(yáng)基因技術(shù)有限公司；Anti-His 抗體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 由本室制備保存；人可溶性 TNFRI 及 TNFRII 購(gòu)自美國(guó) R & D systems 公司；熒光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；TNF 抗原由本研究室表達(dá)、純化獲得，英夫利昔單抗（商品名：Remicade）購(gòu)自美國(guó)強(qiáng)生公司。

1.2 方法

1.2.1 同源模建 根據(jù) Knappik 的聚類(lèi)分析結(jié)果[22]，利用 Homology 模塊對(duì)構(gòu)建的人抗體輕鏈可變區(qū)（拮抗肽 PT7 替換 CDR3）構(gòu)象進(jìn)行模擬。以單域抗體 PTVH5（拮抗肽 PT2、PT3、PT4 依次替換 CDR1、CDR2、CDR3）構(gòu)象為基礎(chǔ)，通過(guò)通用連接肽 (GGGGS)3與構(gòu)建的人抗體輕鏈可變區(qū)構(gòu)象進(jìn)行組合，形成單鏈抗體 scFv，利用Homology 模塊對(duì) scFv 構(gòu)象進(jìn)行模擬。

1.2.2 力學(xué)優(yōu)化 依次選擇 CVFF、Gromos96力場(chǎng)，經(jīng)最陡下降（收斂步長(zhǎng) 6000，收斂判據(jù)0.05 kJ/mol）、共軛梯度（收斂步長(zhǎng) 10000，收斂判據(jù) 0.01 kJ/mol），利用 Discover_3 模塊對(duì)獲得的輕鏈可變區(qū)及 scFv 構(gòu)象進(jìn)行最小化處理。

1.2.3 分子對(duì)接 基于 TNF 晶體結(jié)構(gòu)（PDB 號(hào)：1tnf）以及 TNF/Z12 相互作用復(fù)合物模型，利用Docking 4.0 對(duì)獲得的 scFv 與 TNF-α 作用的復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬。

1.2.4 反向翻譯 針對(duì)理論設(shè)計(jì)獲得的 ScFv_AB1 氨基酸序列，利用 www.expasy.ch/tool 中的 Reverse Translate 程序?qū)ζ溥M(jìn)行反向翻譯，得到其 DNA 序列。選擇 Remicade 的單鏈抗體形式作為陽(yáng)性對(duì)照（命名為 S-Remicade），按照 S-Remicade 的氨基酸序列進(jìn)行反向翻譯，確定其 DNA 序列?？紤]到原核表達(dá)系統(tǒng)，在翻譯過(guò)程中選用偏好密碼子。

1.2.5 重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達(dá)及復(fù)性純化 對(duì)于獲得的 ScFv_AB1、S-Remicade 的基因序列，通過(guò) Overlap PCR 方法進(jìn)行全合成。通過(guò) DNA 片段和質(zhì)粒的酶切、連接反應(yīng)、轉(zhuǎn)化 JM109 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，利用 PCR 方法和酶切方法進(jìn)行鑒定。

利用重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體復(fù)性、重組蛋白純化獲得新抗體。

1.2.6 與 TNF-α 的結(jié)合試驗(yàn) 以 TNF-α（1 μg/ml）包被酶標(biāo)板，4 ℃過(guò)夜；TBST 洗滌 1 遍，10%胎牛血清 37 ℃封閉 1 h；TBST 洗滌 3 遍，加入不同濃度（0.22、0.44、0.88、1.75、3.5 μmol/L）的 ScFv_AB1，37 ℃孵育 1 h；TBST 洗滌 3 遍，加入鼠抗 His 抗體（1:5000），37 ℃孵育 1 h；TBST洗滌 3 遍，加入二抗 GAM-HRP（1:3000），室溫孵育 1 h；TBST 洗滌 3 遍，加入 OPD 底物顯色液，室溫顯色 10 min，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)；492 nm 波長(zhǎng)下測(cè)值。以 S-Remicade 為陽(yáng)性對(duì)照，帶 His-tag 的無(wú)關(guān)蛋白為陰性對(duì)照，所有反應(yīng)液均為每孔 50 μl。

1.2.7 競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn) 以 TNF-α（1 μg/ml）包被酶標(biāo)板，4 ℃過(guò)夜；TBST 洗滌 1 遍，10%胎牛血清 37 ℃封閉 1 h；TBST 洗滌 3 遍，加入 Z12-HRP（1:1600）與不同濃度 ScFv_AB1 的混合液，室溫孵育 1 h；TBST 洗滌 3 遍，加入 OPD 底物，室溫顯色 10 min，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)；492 nm 波長(zhǎng)下測(cè)值。以 IgG 嵌合抗體作對(duì)照，所有反應(yīng)液均為每孔 50 μl。

抑制率按以下公式計(jì)算：

抑制率 =ODZ12 – HRP – ODZ12 – HRP + ScFv_AB1× 100% ODZ12 – HRP

1.2.8 抑制 TNF-α 與 TNFR 結(jié)合的實(shí)驗(yàn) 以TNFRI 或 TNFRII（1.25 μg/ml）包被酶標(biāo)板，4 ℃過(guò)夜；TBST 洗滌 1 遍，10%胎牛血清 37 ℃封閉 1 h；TBST 洗滌 3 遍，加入 TNF-HRP（1:800）與不同濃度 ScFv_AB1 的混合液，室溫孵育 1 h；TBST 洗滌 3 遍，加入 OPD 底物，室溫顯色10 min，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)；492 nm 波長(zhǎng)下測(cè)值。以 S-Remicade 為陽(yáng)性對(duì)照，IgG 嵌合抗體為陰性對(duì)照，所有反應(yīng)液均為每孔 50 μl。

抑制率按以下公式計(jì)算：

抑制率 =ODTNF – HRP – ODTNF – HRP + Inhibitor× 100% ODTNF – HRP

1.2.9 對(duì) TNF-α 細(xì)胞毒的抑制實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的 L929 細(xì)胞用胰酶消化，接種于 96 孔板，3 × 104個(gè)/孔，每孔 80 μl，加入終濃度為 1 μg/ml 的放線(xiàn)菌素 D（dactinomycin D）；加入 TNF-α（終濃度為 10 ng/ml）與不同濃度（0.125、0.25、0.5、1、2 μg/ml）的 ScFv_AB1混合液，每孔 20 μl，37 ℃培養(yǎng) 20 h；加入 MTT（5 mg/ml），每孔 10 μl，37 ℃培養(yǎng) 4 h；加入 MTT 終止液（0.01 mol/L HCl、10% SDS），每孔 100 μl，37 ℃或室溫 8 h；測(cè) 570 nm值。以 S-Remicade、Remicade 為陽(yáng)性對(duì)照，IgG 嵌合抗體為陰性對(duì)照。

抑制率按以下公式計(jì)算：

抑制率 =

ODdactinomycin D + TNF + Inhibitor – ODdactinomycin D + TNF× 100% ODdactinomycin D – ODdactinomycin D + TNF

2 結(jié)果

2.1 單鏈抗體 scFv 的設(shè)計(jì)及空間結(jié)構(gòu)模擬

在單域抗體 PTVH5 的基礎(chǔ)上，以七類(lèi) VL框架為輕鏈候選支架，用活性較好的拮抗肽 PT7 替換 VL框架的 CDR3 區(qū)，并以(GGGGS)3作為柔性linker，設(shè)計(jì)新型 scFv 分子，設(shè)計(jì)中所用的 4 個(gè) TNF-α 拮抗肽（PT2、PT3、PT4、PT7）的氨基酸序列及其在 scFv 中的位置見(jiàn)表 1，組成 7 個(gè) scFv 分子的 VH、VL類(lèi)型見(jiàn)表 2。

在同源模建過(guò)程中，由于靜電斥力和空間位阻的影響，有些 scFv 的三維結(jié)構(gòu)因不合理且不穩(wěn)定，不能通過(guò)同源模建的方法搭建，因此只獲得了3 個(gè) scFv 分子的三維結(jié)構(gòu)模型（ScFv_AB1、ScFv_AB3、ScFv_AB5），如圖 1 所示。

2.2 單鏈抗體 scFv 與 TNF-α 相互作用復(fù)合物的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

借助理論設(shè)計(jì)獲得的新型分子 scFv 空間構(gòu)象（圖 1），以 TNF 晶體結(jié)構(gòu)（PDB號(hào)：1tnf）為模板，考慮靜電互補(bǔ)、結(jié)構(gòu)匹配，通過(guò) TNF/Z12 相互作用的空間結(jié)構(gòu)模式，構(gòu)建 scFv 與 TNF-α 相互作用的立體結(jié)構(gòu)，經(jīng)分子力學(xué)、動(dòng)力學(xué)優(yōu)化獲得復(fù)合物的常溫穩(wěn)定構(gòu)象（圖 2）。從圖 2 可以看出，設(shè)計(jì)獲得的新型單鏈抗體分子 ScFv_AB1、ScFv_AB3、ScFv_AB5 均能夠與 TNF-α 作用。

表 1 TNF-α 拮抗肽的氨基酸序列及在 scFv 中的位置

表 2 組成 scFv 的 VH、VL類(lèi)型

2.3 scFv 與 TNF-α 相互識(shí)別位點(diǎn)判別

根據(jù)模建獲得的 3 個(gè)新型 scFv 分子與 TNF-α 相互作用的復(fù)合物模型，通過(guò)距離幾何學(xué)、計(jì)算機(jī)圖形學(xué)技術(shù)分析它們各自所識(shí)別的 TNF-α 的位點(diǎn)及相關(guān)位置。從表 3 可以看出，ScFv_AB1 與 TNF-α 的作用區(qū)域較廣，識(shí)別的活性氨基酸（位于活性部位的氨基酸）和總氨基酸較多。3 個(gè) scFv 分子都分別能識(shí)別 TNF-α 3 個(gè)活性部位中的兩個(gè)，但 ScFv_AB1 能夠完整地識(shí)別 141 ~ 146 位，其他兩個(gè) scFv 分子只能部分識(shí)別這一活性表位。該表位也是單抗 Z12 識(shí)別并中和 TNF-α 活性的主要位點(diǎn)。鑒于此，ScFv_AB1 最有可能會(huì)中和 TNF-α 的毒性作用。

進(jìn)一步分析 scFv 與 TNF-α 形成的復(fù)合物模型可以發(fā)現(xiàn)，ScFv_AB1 中參與識(shí)別 TNF-α 的氨基酸殘基最多，ScFv_AB1 中 HCDR2（61 ~ 77）、HCDR3（110 ~ 125）、LCDR3（239 ~ 254）參與了識(shí)別 TNF-α；而 ScFv_AB3 和 ScFv_AB5 中，僅 HCDR2（61 ~ 77）和LCDR3（240 ~ 255）參與了識(shí)別作用，HCDR3（110 ~ 125）幾乎不發(fā)揮作用。

綠色飄帶為 VL框架；粉色飄帶為 VH框架；黃色飄帶為 linker；藍(lán)色為 LCDR3（PT7）；深黃色為 HCDR1（PT2）；白色為 HCDR2（PT3）；紅色為 HCDR3（PT4）

Figure 1 The 3-D structure model of scFv molecule based on homology modeling method

綠色線(xiàn)條為 TNF 三聚體，綠色球?yàn)?TNF 被識(shí)別的表位；紅色線(xiàn)條為 VL框架，紅色球?yàn)?LCDR3（PT7）；粉色線(xiàn)條為 VH框架，粉色球?yàn)?HCDR3（PT4）；黃色線(xiàn)條為 linker

Figure 2 The complex structure of TNF and scFv based on computer-guided molecular docking and dynamics simulation methods

表 3 scFv 分子識(shí)別 TNF 三聚體的區(qū)域

注：A、B、C 分別代表 TNF 三聚體中的 3 個(gè)單體；aa：氨基酸。

Notes: A, B and C represent the three monomer of TNF trimer, aa: amino acid.

紅色、粉色和綠色球分別代表 VL、VH和 TNF-α 中發(fā)生相互作用的氨基酸殘基

Figure 3 The localization analysis of the binding domain between scFv and TNF-α

很多研究表明，HCDR3 和 LCDR3 在與抗原結(jié)合中發(fā)揮主要作用，而 HCDR3 看起來(lái)比 LCDR3 更關(guān)鍵[25-26]。由此可見(jiàn)，理論上，ScFv_AB1 的活性要明顯好于 ScFv_AB3 和 ScFv_AB5。

2.4 scFv 分子與 TNF-α 相互識(shí)別模式分析

利用計(jì)算機(jī)圖形學(xué)技術(shù)，結(jié)合 scFv 與 TNF-α 相互識(shí)別位點(diǎn)，確定了 scFv 與 TNF-α 識(shí)別區(qū)域的結(jié)構(gòu)特征，如圖 3 所示，ScFv_AB1 與 TNF-α 作用堆積最為緊密，相互識(shí)別的范圍較廣，而 ScFv_AB3、ScFv_AB5 與 TNF-α 作用面接觸較差，作用分散。

根據(jù)所設(shè)計(jì)的 3 個(gè)scFv分子與 TNF-α 相互作用的復(fù)合物模型，分別計(jì)算它們與TNF-α 相互作用的自由能。從表 4 中可以看出，在 3 個(gè) scFv 分子中，ScFv_AB1 與 TNF-α 之間作用的自由能最低，結(jié)合 TNF-α 的作用最強(qiáng)。

2.5 反向翻譯獲得 ScFv_AB1的 DNA 序列

選擇偏好密碼子，將 ScFv_AB1 的氨基酸序列反向翻譯成 DNA 序列，長(zhǎng) 795 bp，需要全合成的部分為 420 bp（圖 4）。將 ScFv_AB1 序列中需要合成部分的正鏈和負(fù)鏈 DNA 各分成6 段，正鏈與負(fù)鏈中的相應(yīng)兩段重疊 18 ~ 22 bp，有利于 PCR 過(guò)程的延伸。分析每段的二級(jí)結(jié)構(gòu)，修改堿基，消除過(guò)多的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，便于 PCR 擴(kuò)增。

2.6 新型單鏈抗體 ScFv_AB1 的生物學(xué)活性

2.6.1 與 TNF 的特異性結(jié)合 ELISA 結(jié)果表明，ScFv_AB1 能夠與包被在酶標(biāo)板上的 TNF-α 結(jié)合（圖5A），結(jié)合能力隨著 ScFv_AB1 的濃度增加而增加，帶 His-tag 的無(wú)關(guān)蛋白不能與 TNF-α 結(jié)合。

表 4 理論模型下的 scFv 分子與 TNF 的相互作用能（kCal/mol）

Z12-HRP 與不同濃度的 ScFv_AB1 混合，競(jìng)爭(zhēng)與 TNF-α 結(jié)合。競(jìng)爭(zhēng) ELISA 的結(jié)果顯示，ScFv_AB1 可以與 Z12-HRP 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合包被在酶標(biāo)板上的 TNF-α，競(jìng)爭(zhēng)抑制率隨著ScFv_AB1 的濃度增加而增加。這表明 ScFv_AB1 和 Z12 一樣，能與 TNF-α 的 141 ~ 146 功能表位結(jié)合，預(yù)示著ScFv_AB1 能中和 TNF-α 的活性（圖5B）。

2.6.2 ScFv_AB1 抑制 TNF-α 與 TNFR 的結(jié)合 ScFv_AB1 能與 TNF-α 結(jié)合，這促使我們進(jìn)一步去驗(yàn)證 ScFv_AB1 是否能阻斷 TNF-α 與 TNFR 的結(jié)合。結(jié)果表明，ScFv_AB1 能以濃度依賴(lài)方式阻斷 TNF-α 與 TNFRI（圖6A）、TNFRII（圖6B）的結(jié)合，從而可能抑制 TNF-α 的生物活性。ScFv_AB1 濃度為 3.5 μmol/L 時(shí)，抑制率達(dá)到60% 以上。

圖 4 ScFv_AB1 的氨基酸序列反向翻譯成 DNA 序列

Figure 4 The reverse translation of ScFv_AB1

OD4920.90.80.70.60.50.40.30.20.10 競(jìng)爭(zhēng) Z12 結(jié)合 TNF百分率（%）Inhibition of mAb Z12 bindingto TNF (%)706050403020100 1 2 3 4 1 2 3 4 濃度（μmol/L）Concentration (μmol/L)A 濃度（μmol/L）Concentration (μmol/L)B

Figure 5 The specific binding of ScFv_AB1 and TNF (A: The binding between ScFv_AB1 an TNF; B: The competition binding between ScFv_AB1 and Z12)

抑制 TNF 與 TNFRI 結(jié)合百分率（%）Inhibition of TNF bindingto TNFRI (%)9080706050403020100 抑制 TNF 與 TNFRII 結(jié)合百分率（%）Inhibition of TNF bindingto TNFRII (%)80706050403020100 1 2 3 4 1 2 3 4 濃度（μmol/L）Concentration (μmol/L)A 濃度（μmol/L）Concentration (μmol/L)B

Figure 6 Inhibition of ScFv_AB1 to TNF and TNFR (A: Inhibition of TNF and TNFRI; B: Inhibition of TNF and TNFRII)

2.6.3 ScFv_AB1 對(duì) TNF-α 細(xì)胞毒的抑制效應(yīng) 鼠成纖維細(xì)胞 L929 為 TNF-α 特異敏感的靶細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中，在 10 ng/ml rhTNF-α 的作用下，70% 的 L929 細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡的程度與 TNF-α 的活性成正相關(guān)。ScFv_AB1 可明顯抑制 TNF-α 對(duì) L929 細(xì)胞的毒性作用（圖7），但其抑制活性與 S-Remicade 和 Remicade 相比要弱。

抑制 TNF 介導(dǎo)細(xì)胞毒百分率（%）Inhibition of TNF inducedcytotoxicity (%)9080706050403020100 1 2 3 4 濃度（μmol/L）Concentration (μmol/L)

Figure 7 Inhibition effect of ScFv_AB1 on TNF-α induced cytotoxicity

3 討論

研究證實(shí)，源于 TNF-α 中和性抗體的 CDRs 的短肽，或是根據(jù)其 CDRs 合理設(shè)計(jì)的短肽，都能夠與 TNF-α 結(jié)合，其特異性與母本抗體相似，但其活性離臨床應(yīng)用相距甚遠(yuǎn)[27-28]。分析原因可能是：自由的肽可以擁有多種空間構(gòu)象，可能只有一小部分有利的構(gòu)象適于與抗原分子結(jié)合；而且肽分子太小，不具備足夠的空間位阻以阻斷抗原與其受體的結(jié)合[29]。所以，需要一個(gè)合適的框架來(lái)支撐自由的肽，以求獲得有利的空間構(gòu)象、穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)和足夠的空間位阻。

已有很多蛋白框架被開(kāi)發(fā)用于拮抗分子的構(gòu)建[30]。在課題組前期的研究中，曾用人 IgG1 的Fc 片段及人抗體可變區(qū)的 VH5 框架來(lái)展示 TNF-α 拮抗肽[20-21]。結(jié)果表明，與單獨(dú)的肽相比，新構(gòu)建的拮抗分子的活性明顯提高，而且抗體可變區(qū)框架比 Fc 片段更適于作為支架來(lái)展示拮抗肽，這促使我們利用這一合理的設(shè)計(jì)策略進(jìn)一步去開(kāi)發(fā)活性更好的拮抗分子。

在這部分工作中，以前面設(shè)計(jì)的單域抗體 PTVH5（以 VH5 為框架）為基礎(chǔ)，從七類(lèi)輕鏈可變區(qū)框架中選擇與之匹配的 VL框架，以通用的(GGGGS)3為連接肽，設(shè)計(jì)新型單鏈抗體，其中 VL框架的 CDR3 被拮抗肽 PT7 取代。由于前期研究已顯示 LCDR1 和 LCDR2 在與 TNF-α 的結(jié)合中不起主要作用[17, 20]，所以取代不涉及 LCDR1 和 LCDR2。經(jīng)過(guò)同源模建和分子對(duì)接，搭建 TNF/scFv 復(fù)合物模型。分析發(fā)現(xiàn)，以 VH5 和 Vκ1 為框架設(shè)計(jì)的 ScFv_AB1 與 TNF-α 之間的結(jié)合能力較 ScFv_AB3、ScFv_AB5 強(qiáng)，能夠識(shí)別TNF-α 中重要的活性表位 141 ~ 146 位。

純化的 ScFv_AB1 能夠與 TNF-α 結(jié)合、競(jìng)爭(zhēng)性抑制 Z12-HRP 與 TNF-α 的結(jié)合、抑制 TNF-α 介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。但與 S-Remicade 相比，ScFv_AB1 的活性要弱。最大的可能性是，ScFv_AB1 是在 VH5 框架的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的，而 VH5 與Vκ1 可能并非是最佳組合。其他的可能性還有 ScFv_AB1 與 TNF-α 間較弱的氫鍵作用、拮抗肽的效力等。如果進(jìn)一步模建時(shí)考慮所有的 VH和 VL框架，確定拮抗肽的最佳展示位置，可能會(huì)獲得活性更好的拮抗分子。

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Novel human single chain antibody design based on the functional epitope of TNF

CHANG Hong, Lü Ming, QIAO Chun-xia, LI Xin-ying, GENG Jing, ZHOU Ting-ting, LIN Zhou, SHEN Bei-fen, FENG Jian-nan

Developed novel human single chain antibody which design based on the functional epitope of TNF.

In a previous study, we obtained a TNF-α neutralizing mAb Z12 and identified the epitope (from 141 to 146 aa in TNF-α) recognized by Z12. Moreover, we explored a series of TNF-α antagonist peptides (. PT2, PT3, PT4 and PT7) and the single domain antibody PTVH5 (using human antibody frame work of variable region of heavy chain,VH5, as scaffold to display the peptides PT2, PT3 and PT4) based on the interaction between TNF-α and mAb Z12. In the present work, based on the computer-guide molecular design, homology modeling and molecular docking method, we used human antibody frame work of variable region of light chain (Vκ1) as dispalying scaffold and obtained a novel single chain antibody, named as ScFv_AB1, according to the conformation, binding energy and identified domain.

Theoretical analysis showed that ScFv_AB1 was stable and recognized the position 141-146 of TNF-α (same as Z12). Biological experiments showed that ScFv_AB1 could bind to TNF-α, competitively inhibit the binding of mAb Z12 to TNF-α, block the binding of TNF-α to TNFR and inhibit TNF-induced cytotoxicity.

This study demonstrated that it is feasible to design novel single chain antibody based on human antibody consensus frameworks and antagonist peptides using computer-guided modeling method. It also provides an alternative way to obtain human small molecular antibody.

Tumor necrosis factor-alpha; Single-chain antibodies; Computer-aided design; Scaffolds; Homology modeling; Antagonist peptide

SHEN Bei-fen, Email: shenbf0714@163.com; FENG Jian-nan, Email: fengjiannan1970@qq.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.04.001

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31070820）

沈倍奮，Email：shenbf0714@163.com；馮健男，Email：fengjiannan1970@qq.com

2014-05-28

Author Affiliations: Institute of Basic Medical Sciences, Acadamy of Military Medical Sciences; School of Basic Medical Sciences, Beijing 100850, China (CHANG Hong, Lü Ming, QIAO Chun-xia, LI Xin-ying, GENG Jing, ZHOU Ting-ting, LIN Zhou, SHEN Bei-fen, FENG Jian-nan); Hebei College of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200, China (CHANG Hong)