不同菌株發(fā)酵培養(yǎng)過程中脂肪酶活性的檢測與分析

樊國慶，雒曉芳，王 瑾，鄢圣林，閆瑞祥

（1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730030；2.西北民族大學(xué) 實(shí)驗(yàn)中心，甘肅 蘭州730030；）

脂肪酶也就是三酰基甘油?；饷福渥饔玫孜锿ǔ橛椭?，通過催化作用可以使其產(chǎn)生脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯［1］，這個(gè)反應(yīng)通常是在油—水的界面上完成的［2］，如果底物能夠分散均勻或者是具有很好的水溶性，那么反應(yīng)就油［7］.在環(huán)境治理方面，可以用脂肪酶的微生物修復(fù)功能將含有脂肪酶以及其他成分的復(fù)合制劑來作用于海中的石油，就能夠很好地治理海洋中的石油污染［8］.脂肪酶的應(yīng)用廣泛，在食品工業(yè)中，可以用于食品原料的生產(chǎn)［3］，也可以用來作為食品中的添加物質(zhì)［4］，還可以增強(qiáng)食品的品質(zhì)［5］.在醫(yī)藥領(lǐng)域中可以作為診斷工具以及治療藥物［6］，在能源領(lǐng)域，可以用來生產(chǎn)生物柴在有機(jī)合成中的應(yīng)用，利用脂肪酶的催化反應(yīng)特性，即立體選擇性和區(qū)域選擇性，反應(yīng)條件溫和、無污染等等，可以用來合成一些功能強(qiáng)大的化合物［9］.隨著社會(huì)的發(fā)展以及科技的進(jìn)步，脂肪酶的應(yīng)用前景必定會(huì)越來越好.

本試驗(yàn)通過分離選擇得到了不同種的、高效的降解石油的菌株，并且對脂肪酶的形成條件和脂肪酶活性的測定方法進(jìn)行優(yōu)化，這樣有利于工業(yè)生產(chǎn)脂肪的研究以及脂肪酶酶活測定方法的多樣性探討.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選

微生物菌株B1，B3，M3，M4，D1，D4，L5，A6均由西北民族大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室從甘肅隴東油田石油污染土樣中分離純化得到，其分子生物學(xué)鑒定還有待于進(jìn)一步進(jìn)行.

1.1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)基均按照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》［10］配制.

1.1.3 試劑

1）橄欖油（Oliver oil），化學(xué)純，由江蘇省南通市黔臺(tái)商貿(mào)有限公司提供.

2）聚乙烯醇（PVA-124），購自中國醫(yī)藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司.

3）其他試劑全部都是分析純，分別為 （NH4）2·SO4，K2HPO4，KCl，MgSO4·7H2O，F(xiàn)eSO4·7H2O，NaOH，無水乙醇，NaNO3.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的富集

1）富集培養(yǎng)：挑取一環(huán)新鮮斜面種子，接于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)48h.

2）分離：從混濁的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中取樣，用無菌水作10倍稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋 .取稀釋倍數(shù)分別為10、100、1 000的稀釋液，各取0.2mL均涂布于分離平板，顛倒培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱中控制溫度37℃作用60h.如果細(xì)菌的菌落邊緣能夠出現(xiàn)黃色的透明圈，說明這種菌株能很好地降解油脂成分.

3）發(fā)酵培養(yǎng)：通過分離得到高效降油菌后，移取富集培養(yǎng)液1mL轉(zhuǎn)移到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于轉(zhuǎn)速為120r／min的搖床中恒溫37℃，培養(yǎng)48h.

1.2.2 脂肪酶活性的測定方法 橄欖油乳化法1.2.3 脂肪酶酶活的計(jì)算公式

其中：V1實(shí)驗(yàn)組所滴加堿的體積（mL）；V2空白組所用堿的體積（mL）；50～1mL 0.05mol／L NaOH的微克分子數(shù)；n稀釋的倍數(shù)；t反應(yīng)所消耗的時(shí)間（min）.

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對脂肪酶酶活的影響

圖1 溫度對脂肪酶酶活的影響

如圖1所示，菌種B1，M4，D1，L5，A6的脂肪酶酶活都在40℃時(shí)最大，也就是說40℃是其酶促反應(yīng)的最適宜溫度.在40℃之前，隨著溫度的升高脂肪酶酶活會(huì)逐漸升高，而40℃之后，溫度再升高，酶活反而會(huì)降低 .因?yàn)槊甘堑鞍踪|(zhì)，溫度的升高大于其最適溫度時(shí)，酶的空間結(jié)構(gòu)會(huì)被改變而變性，導(dǎo)致其酶活的降低 .菌種B3，D4脂肪酶活性一直處于上升狀態(tài)，菌種M3脂肪酶酶活則一直處于下降狀態(tài)，這三種菌在所測溫度范圍內(nèi)均沒有出現(xiàn)脂肪酶活性的先上升后下降，說明在此溫度范圍內(nèi)可能沒有所測菌種的最適溫度 .陳士恩等［10］關(guān)于酶促反應(yīng)條件的優(yōu)化研究表明，溫度對酶活性的影響呈倒“U”型，即隨著溫度的增加，酶的活性也在增大，當(dāng)溫度增加到某一值時(shí)酶活性達(dá)到最大，之后溫度增加會(huì)使酶活性下降，與本文試驗(yàn)結(jié)果一致.

2.2 反應(yīng)時(shí)間對脂肪酶酶活的影響

圖2 反應(yīng)時(shí)間對脂肪酶酶活的影響

如圖2所示，菌種B1，B3，D1，D4，L5，A6在所測的反應(yīng)時(shí)間范圍內(nèi)，脂肪酶的活性隨著時(shí)間的增加而逐漸升高，說明在所測反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，酶促反應(yīng)一直在進(jìn)行中，所產(chǎn)生的酸不斷增加，導(dǎo)致滴定所消耗的NaOH也不斷增加 .對于菌種M4，酶活隨著反應(yīng)時(shí)間的增加會(huì)先增加后不變，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)所用脂肪酶酶活的計(jì)算公式（V1-V2）×50×n／t，其中體積差表明的是實(shí)驗(yàn)組與對照組所消耗堿量的差，n，t為定值 .時(shí)間增加而酶活不變說明了酶促反應(yīng)仍然在進(jìn)行中，產(chǎn)物的量仍然在增加 .對于菌種M3，如圖所示的曲線，酶活隨著時(shí)間的增加是先增加后減小的 .根據(jù)公式說明，酶活在增加到最大后，酶促反應(yīng)進(jìn)行完全，底物的量也不再增加，而時(shí)間的繼續(xù)增加導(dǎo)致計(jì)算所得的酶活會(huì)變小.

2.3 不同緩沖液量對脂肪酶活性的影響

如圖3所示，對于菌種M3，M4，D1，D4，L5，A6，在所測的緩沖液量的范圍內(nèi)，緩沖液的量對于酶活的影響并不大 .由于脂肪酶對環(huán)境pH的變化比較敏感［11］，加入一定量的緩沖液能夠穩(wěn)定酶的活力，在實(shí)驗(yàn)所測的4～6mL的范圍內(nèi)，緩沖液的體積可以適應(yīng)于體系酸堿的改變，不會(huì)出現(xiàn)所要加入的氫氧化鈉體積的變化 .菌種B1，B3緩沖液的量對其酶活的影響較大，B1在緩沖液為4mL時(shí)，緩沖液的量能應(yīng)對反應(yīng)體系的pH變化 .如果繼續(xù)添加緩沖液，過量的緩沖液會(huì)使滴加的堿液增加，最終會(huì)導(dǎo)致測定結(jié)果偏大，這是由于緩沖液改變了反應(yīng)體系的酸堿度所引起的誤差.

2.4 不同橄欖油濃度對脂肪酶活性的影響

如圖4所示，對于菌種D1，D4，L5，A6，脂肪酶的活力隨著底物橄欖油濃度的增大會(huì)先增大后不變，這是因?yàn)樵诿笣舛炔蛔兊那闆r下，底物濃度對酶活的影響呈現(xiàn)先增加后不變的趨勢 .在底物濃度很低時(shí)，酶活隨底物濃度的增加而增加.當(dāng)?shù)孜餄舛壬揭欢ㄖ禃r(shí)，隨著底物濃度的升高，酶活不再增加，此時(shí)無論底物濃度增加多大，酶活也不再增加，說明酶已被底物所飽和［12］.對于菌株B1、M3隨著底物濃度的增大，酶活會(huì)先增大后減小 .酶活的先增大說明酶還沒有被底物所飽和，隨著底物濃度的增大酶活會(huì)增大，當(dāng)酶被底物所飽和時(shí)，繼續(xù)增大底物濃度，酶活出現(xiàn)減小，這可能是因?yàn)檫^量的底物導(dǎo)致酶與底物—— 油脂相互作用的表面積受到影響 .由于乳化劑增加了反應(yīng)體系的粘度，使反應(yīng)體系的流動(dòng)性變差，底物、產(chǎn)物和酶的擴(kuò)散以及相互接觸也受到一定的抑制，導(dǎo)致酶活的降低［13］.菌種B3，M4出現(xiàn)了酶活隨著底物濃度的增加，先減小后增大，這可能是由于在實(shí)驗(yàn)過程中幾次振蕩橄欖油乳化液不均勻使橄欖油微油粒與酶的接觸表面積大小不一所導(dǎo)致的［14］.

圖4 不同濃度的橄欖油對脂肪酶酶活的影響

3 結(jié)論

1）菌株基本上都是在40℃時(shí)具有最高的酶活，說明此溫度是大多數(shù)細(xì)菌酶促反應(yīng)的最適溫度，故40℃能作為測脂肪酶活性的最適溫度.

2）所用的菌株基本上都是在20min時(shí)具有最高的酶活，說明在實(shí)驗(yàn)所用的范圍中，反應(yīng)時(shí)間越長，酶活越高、酶反應(yīng)越完全，故在設(shè)定酶活測定的條件時(shí)反應(yīng)時(shí)間應(yīng)為20min.

3）所用菌株的最優(yōu)酶活并不表現(xiàn)在某一固定的緩沖液的量，但是每種細(xì)菌酶活對緩沖液的量的變化趨勢起伏并不大，說明緩沖液的量對于本實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌酶活的影響并不大 .基于成本考慮，最優(yōu)緩沖液的量應(yīng)設(shè)定為3mL.

4）所用菌株基本上是在30%的乳化液濃度時(shí)有最優(yōu)酶活，又考慮到微乳顆粒大小，反應(yīng)系統(tǒng)的流動(dòng)性等因素的影響，最優(yōu)的乳化液濃度應(yīng)設(shè)定為30%.

脂肪酶活力的檢驗(yàn)方法很多，通過試驗(yàn)得到在大多數(shù)細(xì)菌中適用的較優(yōu)的酶活測定的反應(yīng)條件：乳化液濃度控制為30%，加入緩沖液3mL，在40℃下，反應(yīng)20min.

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