擬黑多刺蟻（Polyrhachis vicina）性腺雌激素相關(guān)受體基因的表達

歐陽霞輝，侯蘭新，高丹丹，陳 紅

（西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730030）

在哺乳動物中，雌激素及其受體既影響乳腺、子宮和卵巢等生殖系統(tǒng)的生長、分化及功能，又對骨骼、心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用［1］.雌激素受體一旦與雌激素結(jié)合，就會發(fā)生變構(gòu)形成二聚體，然后與雌激素受體反應(yīng)元件（estrogen response element，ERE）結(jié)合，刺激靶基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)雌激素促進細(xì)胞增生、分化和維持正常的生理功能［2］.ERR（Estrogen related receptor，ERR）屬于孤兒核因子受體，在結(jié)構(gòu)上和ER非常類似，它們和ER共同構(gòu)成核因子受體超家族的第三亞族，能夠直接與類固醇受體共激活子結(jié)合激活靶基因的表達 .與ER不同的是，它們不與雌激素結(jié)合，但能夠與雌激素應(yīng)答元件結(jié)合［3］，表明在與共同的共激活子作用時它們之間存在相互競爭作用［4］.

哺乳動物ERRs存在于ERs存在的多種靶器官和組織 .對鼠類的研究發(fā)現(xiàn)，ERRα在各種胚胎組織中都有表達，在胚胎干細(xì)胞中也能檢測到ERRαmRNA的表達，表明ERRα與眾多生理和發(fā)育過程有關(guān) .幾乎在老鼠每一種成體組織中都有ERRα表達，而且在大腦、心臟、骨骼肌、腎、精巢和子宮等部位有高度表達［5，6］.ERRα在ERα存在的丘腦和視丘下部和垂體前葉也有表達，推測它也可能參與了生殖調(diào)控，對ERα的表達起反饋調(diào)節(jié)作用［5］.ERRβ的mRNA表達從原始生殖細(xì)胞遷移到生殖脊開始，一直持續(xù)到兩性性別出現(xiàn)，ERRβ缺失引起生殖腺生殖細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，表明ERRβ明顯參與了生殖腺生殖細(xì)胞的增殖［7］.

盡管對哺乳動物ERR的研究比較深入，但在昆蟲類，雖然Genebank中存在一些昆蟲ERR的序列，也有對黑腹果蠅dERR配體的研究報道［8］，但是有關(guān)ERR功能的研究很少 .何慧等對黃臉油葫蘆雌激素相關(guān)受體TeERR的研究也發(fā)現(xiàn)，TeERR與黃臉油葫蘆的發(fā)育有關(guān)，在幼蟲的胚胎期和生殖腺表達量很高［9］.為了了解pvERR在性腺中的表達情況，我們采用原位雜交技術(shù)對擬黑多刺蟻蟻后卵巢中和雄蟻精巢中pvERR mRNA的表達進行了定位研究，以期為進一步的功能研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以本實驗室飼養(yǎng)的擬黑多刺蟻（Polyrhachis vicina）蟻后和雄蟻為研究對象 .飼養(yǎng)條件：溫度25～28℃，相對濕度80%，光周期12L∶12D.飼料為20%的白糖水和豆餅菜葉.采用經(jīng)過消毒的刀片迅速分別將蟻后、雄蟻的腹部切下，立即放入含有0.1%DEPC的多聚甲醛固定液中固定8h.

1.2 原位雜交

擬黑多刺蟻ERR原位雜交試劑盒（訂制）購自武漢博士德生物工程公司，試劑盒包括：胃蛋白酶；預(yù)雜交液；ERR寡核苷酸探針雜交液（根據(jù)所測擬黑多刺蟻ERR序列設(shè)計，5＇-tgaagcatatctggctcgcaagctgctaaggc-3＇，地高辛標(biāo)記），封閉液，生物素化鼠抗地高辛，SABC，生物素化過氧化物酶.

將固定好的材料放入30%蔗糖溶液中于4℃過夜，用冰凍包埋劑包埋，切片 .切片厚15μm，將切片粘于載玻片上，晾干備用 .實驗流程如下：①洗滌 .將貼有材料的載玻片置于高壓滅菌的0.1%DEPC水中充分洗滌.②封閉內(nèi)源性酶：切片入0.3%H2O2室溫處理30min，0.1%DEPC水洗3次.③暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，37℃消化5min.原位雜交用PBS洗3次，每次5min.④后固定：切片入1%多聚甲醛（含有0.1%DEPC）室溫固定10min，0.1%DEPC水洗3次.⑤預(yù)雜交：每張切片滴加20μL預(yù)雜交液，恒溫箱40℃預(yù)雜交4h.⑥雜交：每張切片滴加20μL雜交液，恒溫箱中40℃雜交過夜.⑦雜交后洗滌：37℃2×SSC洗5min×2次；37℃，0.5×SSC洗15min×1次；37℃0.2×SSC洗15min×2次.⑧滴加封閉液：37℃，30min.⑨滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃，60min，原位雜交用PBS洗4次，每次5min.⑩滴加SABC：37℃，30min，原位雜交用PBS洗3次，每次5min.[11]滴加生物素化過氧化物酶：37℃，30min，原位雜交用PBS洗4次，每次5min.[12]DAB顯色：鏡下控制反應(yīng)時間，一般5～10min，蒸餾水終止反應(yīng) .梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片.Leica光學(xué)顯微鏡觀察.

陰性對照實驗是以預(yù)雜交液代替雜交液進行，其余步驟同上.

1.3 圖像分析

應(yīng)用Leica QWinV3圖像分析系統(tǒng)分別統(tǒng)計陽性反應(yīng)的平均灰度值（灰度分級為0～255級，0級為最黑的灰度，255級為最淺的灰度）.精巢和卵巢分別取5張組織切片，每張切片取6個視野，統(tǒng)計灰度值，應(yīng)用SPSS 11.5的one-way ANOVA進行統(tǒng)計學(xué)分析 .數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，經(jīng)方差齊性檢驗后進行單因素方差分析，并進行LSD檢驗.

2 結(jié)果

2.1 擬黑多刺蟻蟻后卵巢pvERR基因的表達

采用地高辛標(biāo)記的特異寡核苷酸探針雜交結(jié)果顯示，pvERR mRNA在分化期早期的濾泡細(xì)胞胞質(zhì)中就有表達，一直持續(xù)到卵黃積累階段（圖版Ⅰ，1-4）；生長期和卵黃形成期的卵母細(xì)胞胞質(zhì)中有pvERR mRNA陽性反應(yīng)（圖版Ⅰ，3-4）.

2.2 擬黑多刺蟻雄蟻精巢pvERR基因的表達

變形期精細(xì)胞胞質(zhì)有pvERR mRNA陽性反應(yīng)（圖版Ⅱ，1）.成熟精子的頭部和尾部有不同程度的pvERR mRNA陽性表達（圖版Ⅱ，2-3）.

2.3 對照

以預(yù)雜交液代替雜交液的對照實驗結(jié)果為陰性（圖版Ⅰ，5-6；圖版Ⅱ，4）.

2.4 圖像分析及統(tǒng)計結(jié)果

結(jié)果表明，卵子發(fā)生中，pvERR mRNA在濾泡細(xì)胞各個時期的表達差異顯著 .在生長期和卵黃形成期的卵母細(xì)胞表達差異顯著 .卵黃形成期卵母細(xì)胞和濾泡細(xì)胞中的表達差異不顯著（表1）.精巢中，pvERR mRNA在變形期精細(xì)胞和成熟精子頭部和尾部的表達差異顯著（表1）.

表1 擬黑多刺蟻精卵發(fā)生過程中pvERR mRNA原位雜交陽性反應(yīng)灰度值

圖1 pvERR mRNA在擬黑多刺蟻卵巢中的表達

3 討論

昆蟲的生殖雖然受外界環(huán)境因子的影響，但主要受昆蟲體內(nèi)的內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié) .外在因素的作用，常先刺激昆蟲的感受器官，所產(chǎn)生的沖動傳入神經(jīng)系統(tǒng)，由此影響內(nèi)分泌系統(tǒng)的活動，內(nèi)分泌系統(tǒng)的化學(xué)信息傳遞到生殖器官，使后者產(chǎn)生相應(yīng)的生理反應(yīng)，生殖腺的活動又能對內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生反饋式調(diào)節(jié)作用［10］.在昆蟲腦中存在促性腺激素（Gonadotrophins，GtH），昆蟲性腺成熟及精卵成熟也依賴腦分泌的促性腺激素調(diào)節(jié)，它能誘導(dǎo)卵巢和精巢合成蛻皮激素，而蛻皮激素能夠促使脂肪體合成卵黃原蛋白、卵胞細(xì)胞的分化以及刺激精子的發(fā)生［11～14］.

3.1 pvERR基因在卵巢中的表達

擬黑多刺蟻卵巢屬于多滋式 .滋養(yǎng)細(xì)胞和卵母細(xì)胞都是由早期的卵原細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生，一個卵母細(xì)胞周圍有幾十個滋養(yǎng)細(xì)胞 .滋養(yǎng)細(xì)胞通過染色體大量復(fù)制，使其轉(zhuǎn)錄活性升高，合成大量rRNA、mRNA，甚至完整的核糖體，并通過細(xì)胞質(zhì)橋單向運輸給處在發(fā)育階段的卵母細(xì)胞 .在卵母細(xì)胞發(fā)育的一定階段滋養(yǎng)細(xì)胞分解，分解產(chǎn)物進入卵母細(xì)胞 .濾泡細(xì)胞是體細(xì)胞，卵子發(fā)生早期階段，夾雜在生殖細(xì)胞之間 .隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育，它包圍在卵母細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞周圍形成濾泡壁 .濾泡細(xì)胞不僅為卵母細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)的積累，并形成卵黃膜和卵殼，并且在卵母細(xì)胞發(fā)育的過程中提供發(fā)育信息［15］.

圖2 pvERR mRNA在擬黑多刺蟻精巢中的表達

本研究中原位雜交結(jié)果顯示，pvERR mRNA在卵子發(fā)生過程中濾泡細(xì)胞的胞質(zhì)都有陽性表達.隨著卵母細(xì)胞的生長，濾泡細(xì)胞中的表達量逐漸增加 .在卵黃積累階段，pvERR mRNA的表達量顯著減少 .而在卵母細(xì)胞，pvERR mRNA在生長期和卵黃發(fā)生期表達，表達量是逐漸增加的 .在卵子發(fā)生分化階段，隨著滋養(yǎng)細(xì)胞和卵母細(xì)胞分化，濾泡細(xì)胞不斷增殖分裂，所以該時期pvERR mRNA的陽性表達可能與濾泡細(xì)胞自身的增殖和分化有關(guān) .卵母細(xì)胞生長期和卵黃積累階段，濾泡細(xì)胞和卵母細(xì)胞中pvERR mRNA的陽性表達趨勢（濾泡細(xì)胞中逐漸減少，卵母細(xì)胞中逐漸增多）可能說明濾泡細(xì)胞給卵母細(xì)胞提供了發(fā)育信息 .卵黃生成期卵母細(xì)胞中pvERR mRNA的表達可能說明pvERR與卵黃物質(zhì)的形成有關(guān) .蛻皮激素受體通過信號通路調(diào)控卵母細(xì)胞的發(fā)育，控制卵黃蛋白的合成［16～18］.而研究表明，蛻皮激素受體和雌激素受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑非常相似［19～20］，所以推測pvERR可能也是通過蛻皮激素受體信號通路來發(fā)揮作用的.

3.2 pvERR基因在精巢中的表達

昆蟲精子的發(fā)生一般包括三個階段：第一階段主要在胚胎發(fā)育時就已經(jīng)完成，指精原干細(xì)胞在遷移到生殖嵴途中及生殖嵴中進行多次有絲分裂，精原干細(xì)胞的數(shù)目增加；第二階段指幼蟲期的精原干細(xì)胞經(jīng)過增殖和更新成精原細(xì)胞，精原細(xì)胞經(jīng)過兩次連續(xù)的減數(shù)分裂產(chǎn)生四個精子細(xì)胞；第三階段是精子形成期，大多數(shù)種類在成蟲羽化時已經(jīng)有成熟的精子 .在成熟的擬黑多刺蟻雄蟻精巢，本研究中沒有觀察到精子發(fā)生早期的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞，可能說明在變態(tài)為成蟲之前精子發(fā)生就已經(jīng)開始，生精細(xì)胞發(fā)育的同步性比較高.通過原位雜交發(fā)現(xiàn)，變形期的精細(xì)胞胞質(zhì)和成熟精子頭部有很強的pvERR mRNA表達，說明pvERR可能參與了精細(xì)胞的發(fā)育調(diào)控和精子的成熟 .對東亞飛蝗體外抑制實驗研究發(fā)現(xiàn)，蛻皮激素對于飛蝗精子發(fā)生是必需的，能夠保證產(chǎn)生正常發(fā)育的精細(xì)胞和精子［16］.所以推測pvERR可能通過蛻皮激素受體信號途徑對精子進行調(diào)控.

4 結(jié)論

采用地高辛標(biāo)記的特異性寡核苷酸探針對擬黑多刺蟻性腺中pvERR mRNA的表達進行了原位雜交檢測，結(jié)果顯示：pvERR mRNA在卵子發(fā)生過程中濾泡細(xì)胞的胞質(zhì)和生長期、卵黃發(fā)生期的卵母細(xì)胞有表達，在變形期的精細(xì)胞胞質(zhì)和成熟精子頭部有很強的表達 .在卵子發(fā)生分化階段，pvERR mRNA的陽性表達可能與濾泡細(xì)胞自身的增殖和分化有關(guān) .卵母細(xì)胞生長階段，濾泡細(xì)胞和卵母細(xì)胞中pvERR mRNA的表達模式可能說明濾泡細(xì)胞給卵母細(xì)胞提供了發(fā)育信息，而卵黃生成期卵母細(xì)胞中pvERR mRNA的表達可能說明pvERR與卵黃物質(zhì)的形成有關(guān) .變形期的精細(xì)胞胞質(zhì)和成熟精子頭部pvERR mRNA的表達，說明pvERR可能參與了精細(xì)胞的發(fā)育調(diào)控和精子的成熟.

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