灰胸竹雞和棕胸竹雞的線粒體基因組結(jié)構(gòu)分析及比較

黃族豪, 柯坫華，柯娩娟

灰胸竹雞和棕胸竹雞的線粒體基因組結(jié)構(gòu)分析及比較

*黃族豪, 柯坫華，柯娩娟

（井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西，吉安 343009）

竹雞屬包括灰胸竹雞（）和棕胸竹雞（）兩種鳥類。兩種竹雞線粒體基因組全長(zhǎng)為16726 bp，包含13個(gè)蛋白編碼基因、22個(gè)tRNA、2個(gè)rRNA和1個(gè)控制區(qū)?；蚺帕许樞蚺c紅原雞（）一致，屬于典型的鳥類排列順序；堿基組成存在明顯的AT偏向性。兩種竹雞線粒體基因組的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的序列長(zhǎng)度和終止密碼子都完全一樣，但部分編碼基因的起始位置以及起始密碼子存在差異；兩種竹雞的線粒體基因組基因排列緊密；兩種竹雞線粒體全基因組序列之間共有1132個(gè)變異位點(diǎn)，其中缺失位點(diǎn)24個(gè)，遺傳距離為0.071。

線粒體DNA；基因組；灰胸竹雞；棕胸竹雞；比較

隨著DNA測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，許多物種的全基因組序列得到了深入研究。線粒體基因組不含內(nèi)含子[1]，便于分析，已成為研究系統(tǒng)分類最常用的遺傳標(biāo)記。迄今，大量生物的線粒體全基因組被測(cè)定和分析，已測(cè)定的物種數(shù)達(dá)到了數(shù)千種。但絕大多數(shù)研究都是針對(duì)一個(gè)物種的線粒體基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，或?qū)壏N的同源序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生研究，但對(duì)不同物種線粒體基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)比較分析較少[2]。GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)為研究比較不同類群線粒體基因組結(jié)構(gòu)提供了方便。

灰胸竹雞（）和棕胸竹雞（）隸屬雞形目（Galliforms）雉科（Phasianidae）竹雞屬（）?；倚刂耠u是我國(guó)特有種，主要分布于長(zhǎng)江流域以南地區(qū)，北達(dá)陜西南部，西至四川盆地西緣，東及臺(tái)灣??；棕胸竹雞國(guó)內(nèi)見于四川西南部、云南西部和南部，國(guó)外見于越南北部、緬甸和印度等地[3]。黃族豪等[4]報(bào)道了兩種竹雞線粒體DNA控制區(qū)結(jié)構(gòu)比較；Shen et al[5]在研究雞形目鳥類起源進(jìn)化中測(cè)定了包括兩種竹雞在內(nèi)多種雉科鳥類線粒體全基因組，但未對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析。本研究根據(jù)GenBank上的序列對(duì)兩種竹雞線粒體全基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析并比較其異同。

1 材料與方法

1.1 序列來源

從GenBank下載灰胸竹雞（序列號(hào)為EU165706和NC011816）[5]和棕胸竹雞（NC020583和FJ752423）[5]各2個(gè)線粒體全基因組序列。

1.2 序列分析

用Clustal X程序[6]對(duì)DNA序列進(jìn)行對(duì)位排列。用 DnaSP v5.0 軟件[7]確定變異位點(diǎn)。用MEGA5.2[8]統(tǒng)計(jì)堿基組成，并用Kimura雙參數(shù)模型[9]計(jì)算遺傳距離。

2 結(jié)果與討論

2.1 基因組結(jié)構(gòu)與堿基組成

兩種竹雞線粒體基因組長(zhǎng)度均為16,726 bp，包括1個(gè)非編碼區(qū)（D-loop區(qū)）、13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、22個(gè)tRNA基因和2個(gè)rRNA基因（16S rRNA和12S rRNA）。Shields & Helm-Bychowski[10]分析了3目40種鳥類線粒體基因組大小，平均為16.3~17.3 kbp。Desjardins & Morais[11]以原雞（）為材料測(cè)出第一個(gè)鳥類線粒體基因組全序列，長(zhǎng)16,557 bp。我們統(tǒng)計(jì)了GenBank上31種雉科鳥類線粒體基因組平均長(zhǎng)度為16,700 bp（16,677~16,841 bp），竹雞的長(zhǎng)度適中，略高于雉科鳥類的平均值。

兩種竹雞的線粒體基因排列順序與鳥類線粒體基因典型排列順序[12]一致，鳥類線粒體基因典型排列順序與其它脊椎動(dòng)物的不同。首先，輕鏈復(fù)制起始點(diǎn)（OL）是普通存在脊椎動(dòng)物線粒體基因組tRNA-Cys和tRNA-Asn基因間的30~33 bp的非編碼序列，這段序列可形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在脊椎動(dòng)物中是比較保守的，但鳥類缺少這一結(jié)構(gòu)[11]；其次，哺乳動(dòng)物mtDNA中Cytb和ND5基因間由tRNA-Glu和ND6隔開，而竹雞Cyt b和ND5兩個(gè)基因是連續(xù)的，并且tRNA-Glu-ND6基因緊接控制區(qū)（表1）。鵪鶉[13]、雪雁[14]、鷸類[15]和雀形目鳥類[16]線粒體基因組也均是這種排列順序，這在鳥類中可能是一個(gè)普通現(xiàn)象。一些鳥類存在兩個(gè)控制區(qū)，由于基因重排形成不同的基因順序[17-18]，但竹雞屬鳥類只有一個(gè)控制區(qū)。

對(duì)線粒體基因組全序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，兩種竹雞的堿基含量均是C＞A＞T＞G， A+T含量高于G+C含量（表2），存在AT偏向性，與脊椎動(dòng)物線粒體基因組的堿基組成相似[19]。

2.2 蛋白質(zhì)編碼基因

13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因分別為：細(xì)胞色素b基因、細(xì)胞色素C氧化酶3個(gè)亞基基因（COⅠ、COⅡ、COⅢ）、NADH氧化還原酶7個(gè)亞基基因（ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6）以及2個(gè)ATPase亞基基因ATPase6和ATPase8。兩種竹雞線粒體基因組的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的序列長(zhǎng)度都完全一致（表1），顯示編碼基因的保守性，只是ND2、ND3、ND4L、ND4、ND6的起始位置都差一個(gè)堿基（表1）。13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因序列長(zhǎng)合計(jì)11,392 bp，占基因組全長(zhǎng)的68.11%；其中序列最長(zhǎng)的是ND5，達(dá)1,818 bp；最短的是ATPase8，僅為165 bp。與其它雞形目鳥類一樣，兩種竹雞的ND3基因序列174位點(diǎn)存在胞嘧啶的插入現(xiàn)象。

兩種竹雞大部分蛋白質(zhì)編碼基因（ND1、ND2、ND3、ND4L、ND4、ND6、Cyt b、COII、COIII、ATPase 8、ATPase 6)均使用典型的通用起始密碼子ATG，但COI基因采用的是GTG。ND5基因比較特殊，在灰胸竹雞和棕胸竹雞中起始密碼子不一樣，分別是GTG和ATG，兩種竹雞的終止密碼子完全一樣，除COI、ND6分別以AGG、TAG作為終止密碼子， COIII、ND2、ND4是不完全終止密碼子T外，其余蛋白質(zhì)基因的終止密碼子均為TAA。兩種竹雞13個(gè)編碼蛋白基因最常用的起始密碼子是ATG；常用的終止密碼子是TAA，這與其它鳥類相似[20]。COIII、ND2、ND4的密碼子為不完全的終止密碼子T，這種不完全終止密碼子在鳥類中可能是一種普通現(xiàn)象[20]，它通過在3’端添加PolyA完成轉(zhuǎn)譯終止[19]。柯楊等[21]統(tǒng)計(jì)了106種鳥類發(fā)現(xiàn)所有種類的COIII終止密碼子均為T，推測(cè)COIII基因以不完全終止密碼子T作為終止密碼可能是鳥類線粒體基因組密碼子進(jìn)化過程中的一個(gè)共同特征，這種現(xiàn)象在其它的類群中并未出現(xiàn)，比如昆蟲[22-23]、獸類[2]。兩種竹雞Cyt b基因的終止密碼子是TAA，這與其他鳥類類似[24]，但獸類的是AGA[2, 25]（Gissi，1998；魏磊等，2011）。線粒體基因組起始密碼子和終止密碼子的同異性可能在系統(tǒng)進(jìn)化研究中有特殊的意義[22].

2.3 rRNA和 tRNA

12S rRNA和16S rRNA位于tRNA-Phe和tRNA-Leu1之間，兩種rRNA之間由tRNA-Val隔開?；倚刂耠u和棕胸竹雞的16S rRNA序列長(zhǎng)度一樣，均為975 bp；12S rRNA序列長(zhǎng)度分別是974 bp和973 bp，相差僅一個(gè)堿基（表1）。

兩種竹雞線粒體均含有22種tRNA，基因長(zhǎng)度在65-77 bp之間。除了tRNA-Leu和tRNA-Ser各對(duì)應(yīng)2個(gè)tRNA外，其余的氨基酸均只有1個(gè)tRNA與之對(duì)應(yīng)。兩種竹雞的tRNA-Phe、tRNA-Ile、tRNA-Gly、tRNA-Leu2、tRNA-Thr、tRNA-Glu等6種tRNA序列長(zhǎng)度有1個(gè)堿基的差異，其它長(zhǎng)度完全一致（表1）。

2.4 控制區(qū)

控制區(qū)所受進(jìn)化壓力較小，是線粒體基因組中堿基替換和長(zhǎng)度變異最大的區(qū)域[26]?；倚刂耠u和棕胸竹雞的控制區(qū)均位于tRNA-Glu和tRNA-Phe之間，序列分別長(zhǎng)1,146 bp、1,174 bp，相差28 bp。

對(duì)照石雞屬（）鳥類控制區(qū)結(jié)構(gòu)[27]，分析了兩種竹雞控制區(qū)序列，確定了與終止相關(guān)序列（termination assocated sequences，TAS）和重鏈復(fù)制起始區(qū)（origin of H-strand replication，OH），識(shí)別了保守序列框（F-box、E-box、D-box、C-box、CSB1、CSB2、CSB3）、L-鏈和H-鏈啟動(dòng)子（L-strand promoter，LSP；H-strand promoter，HSP）。從圖1中可以看出，兩種竹雞之間，TAS1、TAS2、F-box、E-box、D-bxo、CSB1的序列完全一樣，但C-box有2個(gè)堿基的差異，CSB2/CSB3、 LSP/HSP各有 1個(gè)堿基的差異?？梢?，控制區(qū)保守序列框序列的保守性也是相對(duì)的。

表1 灰胸竹雞和棕胸竹雞線粒體基因組比較

續(xù)表1 灰胸竹雞和棕胸竹雞線粒體基因組比較

Table 1 Comparison of the mitochondrial genome between Bambusicola thoracia and B. fytchii

注：*負(fù)數(shù)代表重疊堿基數(shù).

表2 兩種竹雞線粒體基因組堿基含量

2.5 基因重疊與間隔

動(dòng)物線粒體基因之間的排列十分緊湊，一些相鄰的編碼基因甚至發(fā)生部分堿基的重疊；同時(shí)在一些動(dòng)物線粒體基因組內(nèi)，一些相鄰基因之間往往存在長(zhǎng)度不等的非編碼序列，稱為基因間區(qū)（intergenic spacer, IGS）。兩種竹雞的線粒體基因組基因排列緊密，重疊區(qū)長(zhǎng)度1~10 bp不等(如表1)。灰胸竹雞基因間區(qū)長(zhǎng)度是77 bp，比棕胸竹雞的長(zhǎng)26 bp，兩者主要的差異是灰胸竹雞D-loop基因與和tRNA-Phe基因之間間區(qū)長(zhǎng)度達(dá)到27 bp(如表1)。既沒有重疊，也沒有間隔的緊密排列基因均為9處(如表1)。

Haring, et al[20]統(tǒng)計(jì)9種鳥類線粒體基因間區(qū)，灰頭闊嘴鳥（）的最長(zhǎng)，109 bp，北美潛鴨（）的最短，36 bp?；倚刂耠u和棕胸竹雞的基因間區(qū)分別是77 bp和51 bp，位于Haring et al統(tǒng)計(jì)的范圍之內(nèi)。大多鳥類線粒體基因組重疊的堿基數(shù)在30個(gè)左右，并且ATPase 6 和ATPase 8基因之間大多都有10個(gè)堿基重疊[24]，兩種竹雞也是這樣，這種對(duì)緊縮容量的凈化選擇（purifying selection）作用是動(dòng)物線粒體基因組在進(jìn)化上一個(gè)特點(diǎn)，這對(duì)縮短整個(gè)基因組復(fù)制的時(shí)間十分有利[28]。

2.6 序列差異

對(duì)兩種竹雞線粒體全基因組序列進(jìn)行對(duì)位排列后進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩種鳥類之間共有1,132個(gè)變異位點(diǎn)，其中缺失位點(diǎn)24個(gè)，兩者的遺傳距離為0.071。

對(duì)所有基因分別對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，兩種竹雞的ND1、ATPase 8、tRNA-Tyr、tRNA-Lys、tRNA-Thr和tRNA-Pro等6種基因序列完全一樣，序列差異最大的是ND3基因，達(dá)到0.114（如表1）。可見，ND3的變異速度比較快，是一種可用的遺傳標(biāo)記，已有一些研究人員用其來研究物種的系統(tǒng)發(fā)生[29-31]。

[1] Anderson S, Bankier A T, Barrell B G, et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome[J]. Nature, 1981, 290: 457-464.

[2] 魏磊,吳孝兵,諸立新,等.豹屬線粒體基因組分析[J]. 中國(guó)科學(xué): 生命科學(xué), 2011, 54(10):917-930.

[3] 鄭作新. 中國(guó)動(dòng)物志鳥綱第四卷—雞形目[M]. 北京:科學(xué)出版社,1978.

[4] 黃族豪,張姣,劉迺發(fā).兩種竹雞線粒體DNA的遺傳變異研究[J]. 動(dòng)物學(xué)雜志, 2008, 43(1): 21-25.

[5] Shen Y Y, Liang L, Sun Y B, et al. A mitogenomic perspective on the ancient, rapid radiation in the Galliformes with an emphasis on the Phasianidae[J]. BMC Evolutionary Biology, 2010(1), 10:132.

[6] Thompson J D, Gibson T J, Plewniak F, et al. The Clustal X windows interface flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tool[J]. Nucleic Acid Research, 1997, 25(24): 4876-4882.

[7] Librado P, Rozas J. DnaSP v5. A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics, 2009, 25(11):1451-1452.

[8] Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al.MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods [J]. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28(10): 2731-2739.

[9] Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions though comparative studies of nucleotide sequences[J]. Journal of Molecular Evolution, 1980, 16(2):111-120.

[10] Shields G F, Helm-Bychowski K M.. Mitochondrial DNA of birds[J]. Current Ornithology, 1988(5):273-295.

[11] Desjardins P, Morais R. Sequence and gene organization of the chicken mitochondrial genome. A novel gene order in higher vertebrates[J]. Journal of Molecular Evolution, 1990, 212(4):599-634.

[12] Mindell D P, Sorenson M D, Dimcheff D E. Multiple independent origins of mitochondrial gene order in birds[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1998, 95(18):10693–10697.

[13] Desjardins P, Morais R. Nucleotide sequence and evolution of coding and noncoding regions of a quail mitochondrial genome[J]. Journal of Molecular Evolution, 1991, 32(2): 153-161.

[14] Quinn T W, Wilson A C. Sequence evolution in and around the mitochondrial control region in birds[J]. Journal of Molecular Evolution, 1993, 37(4):417-425.

[15] Wenink P W, Baker A J, Tilanus M G. Mitochondrial control region sequences in two shorebird species, the turnstone and the dunlin, and their utility in population genetic studies[J]. Molecular Biology and Evolution, 1994, 11(1): 22-31.

[16] Marshall H D, Baker A J.. Structural conservation and variation in the mitochondrial control region of fringilline finches (Fringilla spp.) and the Greenfinch (Carduelis chloris)[J]. Molecular Biology and Evolution, 1997,14(2): 173-184.

[17] Eberhard J R, Wright T F, Bermingham E. Duplication and concerted evolution of the mitochondrial control region in the parrot genus Amazona[J]. Molecular Biology and Evolution, 2001, 18(7): 1330–1342.

[18] Gibb G C, Kardailsky O, Kimball R T, et al. Mitochondrial genomes and avian phylogeny: complex characters and resolvability without explosive radiations[J]. Molecular Biology and Evolution, 2007, 24(1):269-280.

[19] Clayton D A. Replication and transcription of vertebrate mitochondrial DNA[J]. Annual Review of Cell Biology, 1991, 7(1): 453-478

[20] Haring E, Kruckenhauser L, Gamauf A, et al. The complete sequence of the mitochondrial genome of Buteo buteo(Aves, Accipitridae) indicates an early split in the phylogeny of raptors[J]. Molecular Biology and Evolution,2001, 18(10):1892-1904.

[21] 柯楊, 黃原, 雷富民. 黑尾地鴉線粒體基因組序列測(cè)定與分析[J]. 遺傳, 2010, 32(9): 951-960.

[22] 曹天文, 王菊平, 宣善濱, 等. 貓蛺蝶線粒體基因組全序列分析[J]. 動(dòng)物分類學(xué)報(bào), 2013, 38(3): 468-475.

[23] 王菊平, 聶新平, 曹天文, 等. 大紫蛺蝶線粒體基因組全序列分析[J]. 動(dòng)物分類學(xué)報(bào), 2012, 37(1): 1-9.

[24] Nishibori M, Tsudzuki M, Hayashi T, et al. Complete nucleotide sequence of the Coturnix chinensis (blue-breasted quail) mitochondrial genome and a phylogenetic analysis with related species[J]. Journal of Heredity, 2002, 93(6): 439-444.

[25] Gissi C, Gullberg A, Arnason U. The Complete mitochondrial DNA sequence of the Rabbit (Oryctolagus cuniculus) [J]. Genomics, 1998, 50(2):161-169.

[26] Boore J L, Daehler L L, Brown W M. Complete sequence, gene arrangement, and genetic code of mitochondrial DNA of the cephalochordate Branchiostoma floridae (Amphioxus) [J]. Molecular Biology and Evolution, 1999, 16(3): 410-418.

[27] Randi E, Lucchini V. Organization and evolution of the mitochondrial DNA control region in the avian genus Alectoris[J]. Journal of Molecular Evolution, 1998, 47(4): 449-462.

[28] 黃族豪, 劉迺發(fā).動(dòng)物線粒體基因組變異研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)研究, 2010, 14(2):166-171.

[29] Docker M F, Youson J H, Beamish R J, et al. Phylogeny of the lamprey genus Lampetra inferred from mitochondrial cytochrome b and ND3 gene sequences[J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 1999, 56(12): 2340-2349.

[30] Takacs Z, Morales J C, Geissmann T, et al. A complete species-level phylogeny of the Hylobatidae based on mitochondrialgene sequences[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2005, 36(3): 456-467.

[31] Wang W, Forstner M R J, Zhang Y, et al. A Phylogeny of Chinese leaf monkeys using mitochondrial ND3-ND4 gene sequences[J]. International Journal of Primatology, 1997, 18(3): 305-320.

THE STRUCTURE OF COMPLETE MITOCHONDRIAL GENOME AND ITS COMPARISON BETWEEN

*HUANG Zu-hao, KE Dian-hua, KE Wan-juan

(School of Life Sciences, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China)

Two species ofwere recognized asand. The entire mitochondrial genome of the two species is 16,726 bp in length, which contains 13 protein coding genes (PCGs), 22 tRNA, 2 rRAN, and one control region. The mitochondrial genomic organization and gene order are consistent with that of, belonging to typical gene order within birds, and the base composition exists obviously AT bias. The sequence length and teminator codon of the 13 PCGs of two species are just the same, but the initial position and codon of some PCGs are different. There are 1132 variable sites between the two species with 24 deletes among which, and the genetic distance between the two species is 0.071.

mitochondrial DNA; genome;;; comparison

Q959

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2014.06.022

1674-8085(2014)06-0100-07

2014-09-09；

2014-10-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260088)；江西省主要學(xué)科學(xué)術(shù)帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目；江西省“贛鄱英才555工程”項(xiàng)目；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20132BAB204022)

*黃族豪(1975-)，男，湖南新寧人，教授，博士，主要從事鳥類分子生態(tài)學(xué)研究( E-mail: hzhow@163.com);

柯坫華(1972-)，男，江西彭澤人，講師，博士，主要從事鳥類學(xué)和動(dòng)物行為學(xué)研究(E-mail: ssk002whu@163.com);

柯娩娟(1990-)，女，湖北黃石人，井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)專業(yè)2010級(jí)本科生(E-mail: kewanjuan@163.com).