結核分枝桿菌Rv3871抗原優(yōu)勢肽段的克隆表達及抗原性鑒定

郄霜，戴振華，楊錫琴，修冰水 ，陳堃 ，郭蘭芹，馮曉燕，張慶波，張賀秋

1.河北聯(lián)合大學，河北 唐山 063000；2.軍事醫(yī)學科學院 基礎醫(yī)學研究所，北京 100850；3.華北石油總醫(yī)院，河北 任丘 062552

結核分枝桿菌感染所導致的結核病對人類健康依然是極大的威脅，全世界高達三分之一的人口是潛在的結核分枝桿菌感染患者，每年平均死亡人數(shù)達到170萬[1]。目前我國結核病診斷及流行病學調查主要采用結核菌素純蛋白衍化物（PPD）檢測，但PPD檢測包含的抗原復雜，導致難以區(qū)別結核桿菌感染和卡介苗接種，因此，尋找特異性更高、敏感性更強的抗原是目前結核病診斷研究的首要任務。

致病性結核分枝桿菌區(qū)別于卡介苗（BCG）的一個重要特征是，結核分枝桿菌的基因組中存在RD1區(qū)，而所有環(huán)境分枝桿菌及BCG中均缺失該區(qū)序列。研究表明，敲除RD1區(qū)的結核分枝桿菌H37RV與BCG疫苗株的毒力相當，因此推斷RD1區(qū)與細菌的毒力有關[2]。我們對H37RV株RD1區(qū)的Rv3871抗原優(yōu)勢肽段進行了克隆、表達及純化，初步檢測了其抗原性，希望為結核病的臨床檢測提供新型抗原。

1 材料和方法

1.1 材料

所有血清均來自北京市朝陽區(qū)疾病預防控制中心，全部為臨床新近診斷的活動性肺結核患者，未合并感染HIV，未接受抗結核治療或治療時間不超過2周；陰性對照組來自健康獻血員。

結核分枝桿菌H37Rv基因組DNA、大腸桿菌HB101由本室保存；在大腸桿菌中高效表達目的基因的載體pBVIL1由本室構建；實驗所需DNA限制性內切酶XhoⅠ和XbaⅠ，及T4DNA連接酶均購自Promega公司。

1.2 抗原表位分析

用Biosun分子生物學軟件對Rv3871抗原進行表位分析，將其分成3個優(yōu)勢抗原表位，分別為Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3。

1.3 基因克隆與載體構建

針對用Biosun軟件分析而得的Rv3871的3段優(yōu)勢肽段基因序列及質粒pBVIL1克隆位點序列設計PCR引物。Rv3871-1基因上游引物為P1（5'-GCC TCGAGACTGCTGAACCGGAAGTACGGA-3'），下游引物為 P2（5'-GCTCTAGAACCGGGCCATCCGTCG ATGAT-3'）；Rv3871-2基因上游引物為 P3（5'-GC CTCGAGATCGCTTCCCAGCACACCGAA-3'），下 游引物為 P4（5'-GCTCTAGAAATCTCCCAGCGAGTG CGGTA-3'）；Rv3871-3基因上游引物為P5（5'-GC CTCGAGATCGCTTCCCAGCACACCGAA-3'），下 游引物為 P6（5'-GCTCTAGAACCGGGCCATCCGTCG ATGAT-3'）。上、下游引物5'端分別引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位點。

以結核分枝桿菌H37Rv株基因組為模板進行PCR擴增，反應體系包括H37Rv株基因組DNA 1.0 μL、超純水45 μL、酶50 μL、引物各2.0 μL，總體積為100 μL。反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA膠回收試劑盒純化回收擴增產物，由中美泰和生物技術公司測序，將測序正確的目的基因用XhoⅠ和XbaⅠ酶切，并將其與經相同酶切的pBVIL1原核表達載體連接構成重組質粒，將重組質粒轉化大腸桿菌HB101，對氨芐西林（Amp）抗性培養(yǎng)菌落進行菌落PCR鑒定，并對重組質粒進行雙酶切鑒定，陽性克隆用于誘導表達。

1.4 表達純化

將重組質粒轉化大腸桿菌HB101，挑取單一克隆接種于2 mL LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp），37℃搖床振搖培養(yǎng)過夜，次日以1∶100的比例接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp），37℃振搖培養(yǎng)2～3 h，轉至42℃水浴誘導表達4 h以上，收集菌體，提取包涵體與上清，進行SDSPAGE。重組蛋白的純化參照文獻[5]進行。

1.5 活性檢測

用純化的結核分枝桿菌抗原Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3分別包被酶聯(lián)測定板，用間接ELISA方法檢測結核陽性患者和健康獻血員，測定D450nm值，評價抗原的反應活性。

2 結果

2.1 抗原表位分析

圖1 Biosun分子生物學軟件對Rv3871抗原的分析結果

用Biosun分子生物學軟件對Rv3871抗原進行抗原表位分析，將Rv3871抗原分成3個優(yōu)勢抗原表位，分別為 Rv3871-1（10～190 aa）、Rv3871-2（310～370 aa）和Rv3871-3（510～580 aa）（圖1）。

2.2 PCR產物的瓊脂糖電泳鑒定

以H37Rv基因組DNA為模板，分別擴增Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3抗原基因片段，相應的PCR產物大小分別為540、180和210 bp（圖2）。

2.3 重組質粒的測序鑒定

用XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切擴增的基因，得到相應的目的基因，連接到經同樣雙酶切的pBVIL1載體上，構建成重組質粒，重組質粒的測序結果表明所擴增的基因序列完全正確（序列略）。

2.4 抗原的表達純化

將重組質粒轉化大腸桿菌HB101，對經PCR鑒定和酶切鑒定陽性的克隆進行熱誘導。由于目的基因與載體上的一段IL1基因相融合，因此表達的Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3重組蛋白的相對分子質量分別約為 39.2×103、21.6×103和 22.5×103。將大量誘導表達的菌體用超聲波破碎，對表達于包涵體內的各重組蛋白進行離子交換柱純化。相關SDS-PAGE結果如圖3。

2.5 間接ELISA檢測抗原活性

圖2 抗原基因片段PCR產物瓊脂糖電泳結果

分別用純化的抗原Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3包被酶聯(lián)板，通過ELISA方法檢測40例結核病患者、36例健康體檢者，對檢測結果用Graph?Pad Prism 4軟件進行統(tǒng)計學分析，確定cut-off值，表明差異有統(tǒng)計學意義（圖4）。對3個抗原優(yōu)勢肽段進行IgG檢測，Rv3871-1的敏感性為32.5%（13/40，t=6.091，P＜0.001），特異性為97.2%；Rv3871-2的敏感性為45%（18/40，t=5.756，P＜0.001），特異性為100%；Rv3871-3的敏感性為37.5%（15/40，t=4.847，P＜0.001），特異性為91.6%。Rv3871-2優(yōu)勢肽段的檢測效果最佳。參見表1、2。

3 討論

圖3 重組菌的SDS-PAGE

表1 抗原優(yōu)勢肽段Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3的ELISA檢測結果

表2 抗原優(yōu)勢肽段Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3的特異性和敏感性

圖4 Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3抗原的活性

對于結核病的血清學檢測，檢測試劑的敏感性與特異性一直是困擾科研工作者和醫(yī)務人員的難題，其主要原因是檢測試劑所用的抗原種類和質量問題仍未解決。因此，尋找敏感性高、特異性好的結核病診斷抗原一直是研究重點[6]。目前比較成熟的結核病診斷試劑盒大多選用分泌性抗原或多抗原聯(lián)合檢測[7]。本研究主要針對結核分枝桿菌H37Rv株RD1區(qū)編碼蛋白進行。RD1區(qū)編碼蛋白（Rv3871～Rv3879c）是結核分枝桿菌在長期傳代過程中丟失的特異性保護性抗原，僅存在于致病性結核分枝桿菌中，在BCG及環(huán)境分枝桿菌中缺失[8]，從而使其在結核病的免疫學診斷和預防中發(fā)揮重要作用。Rv3871是膜結合ATP水解酶的組成部分，是轉錄形成單位，有2個ATP/GTP結合位點[9]。

目前關于Rv3871蛋白的研究較少。我們對Rv3871抗原進行了表位分析，將該抗原分成3段，利用本室構建的原核表達載體pBVIL1進行抗原優(yōu)勢肽段的表達純化，發(fā)現(xiàn)3個抗原優(yōu)勢肽段都能高效表達。在先前的研究中，曾用多種載體對Rv3871抗原進行全長表達，但均未成功。本研究中，通過表達抗原優(yōu)勢肽段，避免了由于抗原本身分子較大，不易表達的缺點。

通過間接ELISA法對3個抗原優(yōu)勢肽段免疫活性進行初步檢測，發(fā)現(xiàn)Rv3871-2抗原優(yōu)勢肽段的敏感性和特異性均高于Rv3871-1和Rv3871-3。由此可以推斷Rv3871-2抗原在3個抗原中效果最佳。

抗原優(yōu)勢肽段的檢測可以克服抗原蛋白分子較大而不易克隆表達的缺點，同時也可以克服由于蛋白自身結構復雜，相互折疊，使線性表位被覆蓋而不能充分表現(xiàn)其抗原活性的缺點。本研究結果表明，Rv3871-2抗原在pBVIL1載體中可以高效表達，同時該抗原在3個優(yōu)勢肽段中活性最好。該抗原可以與其他RD1區(qū)抗原如ESAT-6、CFP-10聯(lián)合用于檢測，以提高檢出率，同時又可以保持特異性。但是目前對Rv3871抗原的研究較少，需要進一步擴大臨床樣品評價，探討抗原在結核病檢測中的應用價值。

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[7]郄霜,戴振華,馮曉燕,等.重組結核分枝桿菌抗原在結核病診斷中的應用[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2013，23(4):1051-1053.