人激活轉(zhuǎn)錄因子5基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其生物學(xué)功能研究

符靜，徐小潔，劉家宏，，田沛榮，范忠義，呂朝暉，王濤，朱建華，陸菊明，葉棋濃

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；2.解放軍總醫(yī)院 內(nèi)分泌科，北京 100853；3.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，北京 100039

人轉(zhuǎn)錄激活因子5（activating transcription fac?tor 5，ATF5）屬于轉(zhuǎn)錄因子ATF/CREB家族，具有堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，B-ZIP）特異性結(jié)構(gòu)域[1]，在細(xì)胞的生長、增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[2]。ATF5能促進腫瘤存活[3-4]，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胸腺瘤、甲狀腺癌、前列腺癌組織中表達(dá)上調(diào)[4-7]，而在一些腫瘤中降低ATF5表達(dá)后會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡[3-9]，對正常細(xì)胞則沒有明顯作用。這提示ATF5在腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和死亡中起重要作用。此前，ATF5與腫瘤關(guān)系的研究大多集中于ATF5在凋亡中的作用，而最近的一項研究[10]表明，在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中，ATF5能夠通過升高雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）的水平抑制自噬。

我們擬構(gòu)建ATF5的真核表達(dá)載體，并驗證其升高mTOR水平的功能，為進一步研究ATF5與自噬的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎293T細(xì)胞由本室傳代培養(yǎng)；pXJ-40-myc載體為本實驗室保存；VigoFect為威格拉斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、PCR試劑均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取、膠回收、PCR回收試劑盒購自Promega公司；DMEM及小牛血清均購自Gibco公司；測序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2 myc-ATF5重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測序

以本實驗室保存的XL5-ATF5質(zhì)粒作為模板，根據(jù)文獻報道的ATF5的編碼序列合成引物。上游引物為5'-CGGGATCCATGTCACTCCTGGCGACCC TGG-3'，下游引物為5'-CCCAAGCTTCTAGCAGCT ACGGGTCCTCTGGCTC-3'。利用PCR方法擴增人ATF5的編碼序列，按以下條件進行片段的擴增：95℃預(yù)變性5 min，然后以95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸1 min進行31個循環(huán)，72℃延長7 min。用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切pXJ-40-myc載體，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR片段回收后再用BamHⅠ和HindⅢ酶切，形成帶有粘端的雙鏈，用T4DNA連接酶連接入pXJ-40-myc載體中；轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，搖菌并提質(zhì)粒，用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，將酶切鑒定正確的克隆送北京奧科生物公司測序。

1.3 哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染和Western印跡檢測

按常規(guī)方法進行轉(zhuǎn)染，用不含雙抗、含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將293T細(xì)胞接種于6 cm皿中，接種量以轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá)到80%為宜，培養(yǎng)24 h后進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 h換液。將4 μL VigoFect與200 μL NaCl混合，再將總量為10 μg的重組質(zhì)粒與200 μL NaCl混合，然后將上述2種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入6 cm皿中，并以同樣方法轉(zhuǎn)染空pXJ-40-myc載體作為對照，37℃、50 mL/L CO2常規(guī)培養(yǎng)，4～6 h換液。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞蛋白，加入2×SDS加樣緩沖液，煮沸10 min，高速離心2 min，取上清液進行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉于4℃封閉過夜，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000稀釋的用HRP標(biāo)記的抗myc標(biāo)簽鼠單克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和空載體后，用上述方法行Western印跡至5%脫脂奶粉，于4℃封閉過夜后，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000稀釋的抗mTOR的兔多克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；加入用5%脫脂奶粉稀釋的以1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

1.4 總RNA提取

分別轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒和空載體的細(xì)胞棄培養(yǎng)基，1×PBS洗滌，用1 mL TRIzol溶液吹下細(xì)胞，加0.2 mL氯仿提取蛋白混勻，室溫放置10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，小心取上清液0.4 mL，加等量異丙醇混勻，-20℃冷凍10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，用1 mL 75%乙醇（DEPC水稀釋）洗1次，4℃、12 000 r/min離心5 min后棄上清，用無水乙醇洗1次，4℃、12 000 r/min離心5 min后棄上清，自然干燥RNA約30 min，加入20 μL DEPC水溶解沉淀，即為提取的總RNA。

1.5 qRT-PCR檢測

取2 μg總RNA，與1 μL 50 μmol/L的隨機引物混勻，補水至15.9 μL，70℃解鏈5 min，自然冷卻至室溫，加入反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、RNA酶抑制劑及反轉(zhuǎn)錄緩沖液，剩余補水至終體積25 μL，42℃反應(yīng)1 h，95℃滅活5 min，得到反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈，將其1∶20稀釋，取9.2 μL模板與10 μL SYBR Green Mix（2×）、上下游引物各0.4 μL混勻進行qRT-PCR，所得數(shù)據(jù)按2-ΔΔCt公式計算出基因表達(dá)的相對量。

2 結(jié)果

2.1 myc-ATF5重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以實驗室保存的XL5-ATF5質(zhì)粒為模板，PCR擴增人ATF5的編碼序列，獲得長約850 bp的DNA片段，與預(yù)期片段大小一致（圖1）。將PCR產(chǎn)物用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后與經(jīng)同樣酶切的pXJ-40-myc載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，進行菌液PCR鑒定，若獲得與目的條帶850 bp大小接近（圖2）的克隆，則初步認(rèn)為是帶有人ATF5基因的陽性重組克隆。將所得陽性克隆提質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，可切出2條長度分別約為5000和850 bp的條帶，而相應(yīng)的空載體酶切只見大片段，符合預(yù)期結(jié)果（圖3）。測序結(jié)果表明，插入片段的DNA序列與人ATF5基因的編碼序列完全一致（數(shù)據(jù)略）。

2.2 Western blot檢測myc-ATF5及mTOR在293T細(xì)胞中的表達(dá)

將構(gòu)建的myc-ATF5重組質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系，24 h后提取蛋白進行SDS-PAGE，Western印跡檢測myc-ATF5和mTOR的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，用myc-HRP抗體能夠在相對分子質(zhì)量約40×103處檢測到明顯的特異性條帶，空載體無條帶；與空載體對照相比，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后mTOR蛋白水平升高（圖4）。說明myc-ATF5重組蛋白在293T細(xì)胞中能正確表達(dá)，且能升高mTOR的蛋白水平。

2.3 ATF5在mRNA水平升高mTOR

收集轉(zhuǎn)染了myc-ATF5和空載體的293T細(xì)胞，提取總RNA，行qRT-PCR，引物采用文獻報道的序列[10]。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染myc-ATF5后，mTOR的mRNA水平明顯升高（圖5）。

圖1 PCR擴增人ATF5的編碼序列

圖2 重組質(zhì)粒myc-ATF5的菌液PCR結(jié)果電泳圖譜

圖3 重組質(zhì)粒myc-ATF5的BamHⅠ/HindⅢ雙酶切電泳圖譜

3 討論

ATF5是核轉(zhuǎn)錄因子ATF/CREB家族的成員，該家族成員均包含特征性B-ZIP的C端cAMP效應(yīng)元件（cAMP responsive element，CRE）。作為 cAMP/PKA通路的核內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，ATF/CREB能對許多生長因子及肽類激素的刺激做出反應(yīng)，通過與多種蛋白質(zhì)結(jié)合為同源或異源二聚體而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，參與細(xì)胞生長、分化、應(yīng)激和凋亡等重要生命過程[1]。其中ATF5位于染色體19ql3.33，其編碼的蛋白含有282個氨基酸殘基，此蛋白由含有B-ZIP（209～269殘基）的C端序列、中央富含脯氨酸的DNA轉(zhuǎn)錄激活區(qū)和非保守的N端序列構(gòu)成，其中BZIP是ATF5與特異性DNA序列結(jié)合的功能區(qū)域[11]。

ATF5的功能復(fù)雜，目前尚未完全闡明?，F(xiàn)有研究表明ATF5參與神經(jīng)祖細(xì)胞、肝細(xì)胞等的分化，參與細(xì)胞增殖、凋亡、應(yīng)激的調(diào)控[12-15]。最近的研究報道，在BCR-ABL基因易位的慢性髓樣白血病細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/FOXO4/ATF5/mTOR信號通路，由此首次發(fā)現(xiàn)了ATF5調(diào)控自噬的功能[9]。在此通路中，AKT磷酸化FOXO4，使其從細(xì)胞核內(nèi)移出，隔離在胞質(zhì)區(qū)，阻礙其調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。ATF5是FOXO4的下游基因，F(xiàn)OXO4功能被AKT抑制后，對ATF5的轉(zhuǎn)錄抑制減弱，使得ATF5在轉(zhuǎn)錄水平升高。ATF5可與mTOR結(jié)合而升高mTOR的水平，因此抑制自噬。自噬是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象，貫穿于正常細(xì)胞生長發(fā)育和多種生理病理過程。自噬在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療中都起重要作用。自噬的調(diào)控主要受位于ATG上游的PI3K-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和Beclin 1復(fù)合物調(diào)節(jié)[16-17]，其中PI3K-mTOR通路是自噬活性調(diào)節(jié)的核心。在BCR-ABL基因易位的慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中，被ATF5升高的mTOR，與PI3K/AKT通路中其他成員激活的mTOR一起抑制自噬。

圖4 Western印跡檢測myc-ATF5和mTOR的表達(dá)

圖5 qRT-PCR檢測ATF5對mTOR的影響

本實驗構(gòu)建的myc-ATF5在真核細(xì)胞中獲得了表達(dá)，并驗證了表達(dá)的融合蛋白能夠在mRNA和蛋白水平升高mTOR。ATF5在真核細(xì)胞中的成功表達(dá)，是繼續(xù)深入研究其在自噬中的作用機制，以及探討其利用價值的基礎(chǔ)。

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