肝硬化小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及血清炎性因子的變化

魏曉，楊展，崔茜，鄒大陽，閆夏貝，王思淼，黃留玉，袁靜

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 疾病預(yù)防控制所，北京 100071

肝硬化的病理學(xué)標(biāo)志是瘢痕組織替代了正常的肝臟軟組織，門脈高壓，阻止血流通過肝臟，導(dǎo)致胃腸道淤血、組織水腫、胃腸蠕動減慢、腸道通透性增加，同時(shí)，肝功能損害導(dǎo)致對藥物、氨基酸等的清除功能下降，并且膽汁和膽酸分泌減少[1]，直接影響到腸道微生物結(jié)構(gòu)的變化，腸道菌群的紊亂變化也有可能導(dǎo)致血液炎性因子發(fā)生變化。

我們通過CCl4灌胃法構(gòu)建了昆明小鼠肝硬化的動物模型，并結(jié)合熒光定量PCR及酶聯(lián)免疫分析（ELISA）實(shí)驗(yàn)，對肝硬化小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及血液炎性因子的變化進(jìn)行了研究和分析。

1 材料與方法

1.1 肝硬化小鼠動物模型的建立

清潔級昆明小鼠60只，6周齡，雌雄各半，體質(zhì)量為30～35 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，正常飼喂，統(tǒng)一飲水。將小鼠分為對照組和造模組，各30只，每組雌雄各半。對照組小鼠無菌灌胃花生油溶液，造模組小鼠無菌灌胃體積分?jǐn)?shù)為40%的CCl4花生油溶液，首次灌胃劑量為5 mL/kg，之后每周灌胃2次，每次劑量均為3 mL/kg，持續(xù)16周。

1.2 肝臟組織病理檢測

造模后的0、4、8、12、16周，分別隨機(jī)處死1只造模小鼠，處死前對小鼠禁食禁水24 h。解剖肝臟，觀察組織病變情況。如病理檢測結(jié)果顯示出現(xiàn)典型的肝小葉結(jié)節(jié)，說明造模成功。

1.3 小鼠腸道目的菌群的熒光定量PCR檢測

60只小鼠分別在給藥前及造模成功后采集新鮮的糞便樣品，置于滅菌的Eppendorf管中，-80℃保存。用試劑盒（QIAamp DNA Stool Mini Kit）提取糞便樣品中的全基因組DNA。腸道目的菌群的特異性引物由上海生工生物工程公司合成（表1）。

采用MJ Opticon-2定量PCR儀（Bio-Rad公司）及其配套分析軟件（MJ Opticon Monitor分析軟件，V3.1）測定小鼠腸道目的菌群的變化。定量試劑采用SYBR@Premix EX Taq試劑盒（TaKaRa生物工程公司）。熒光定量PCR（RT-PCR）反應(yīng)體系為20 μL，包括2×SYBR Premix EX Taq 10 μL、引物0.5 μL、模板DNA 1 μL、滅菌去離子水8.5 μL。RTPCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性1 min，然后以94℃變性40 s、退火30 s（不同目的菌群退火溫度詳見表1）、72℃延伸45 s循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min。循環(huán)結(jié)束，通過分析RT-PCR反應(yīng)的融解曲線來決定產(chǎn)物的特異性，從60到95℃，每升溫0.2℃且持續(xù)10 s后，自動采集反應(yīng)管中反應(yīng)液的熒光信號。

1.4 小鼠血液炎性指標(biāo)的監(jiān)測

造模后0、4、8、12、16周，對小鼠尾部采血，每只小鼠采血1 mL，置于滅菌的Eppendorf管中，3000 r/min離心20 min，取上清，-80℃保存。分別采用小鼠內(nèi)毒素、IL-1、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）檢測血清內(nèi)毒素及炎性因子（IL-1、IL-6、TNF-α）水平的變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS軟件，采用Wilcoxon非參數(shù)檢驗(yàn)對小鼠腸道菌屬豐度的變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Stu?dent t檢驗(yàn)對小鼠血清內(nèi)毒素及細(xì)胞因子的水平差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠外觀

造模組小鼠在造模過程中活動量較少，精神狀態(tài)較差，對外界反應(yīng)較遲鈍，毛發(fā)無光澤，體重增長緩慢，第8周開始排黑便。正常對照組小鼠體態(tài)活潑，毛發(fā)有光澤，食欲正常，大便正常。

2.2 肝臟組織病理學(xué)

造模組和對照組小鼠均無意外死亡。CCl4給藥后0、4、8、12、16周分別隨機(jī)處死1只小鼠，共5只，觀察肝臟病理進(jìn)展（圖1），至CCl4給藥后16周，造模組小鼠全部誘導(dǎo)出肝硬化。

2.3 肝硬化小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化

小鼠糞便中目的菌屬的含量以每克濕便含16S rRNA基因拷貝數(shù)表示，將每克濕便所含的16S rRNA基因拷貝數(shù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用熒光定量PCR法檢測肝硬化小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果顯示，造模前60只小鼠腸道特定菌屬的豐度無顯著差異；在造模第16周，對照組小鼠腸道中特定菌屬豐度無顯著變化，而造模組小鼠擬桿菌屬（P＜0.01）和梭菌屬（P＜0.05）細(xì)菌顯著減少，韋榮球菌屬（P＜0.05）、腸桿菌屬（P＜0.01）和腸球菌屬（P＜0.01）細(xì)菌顯著增加（圖2）。

表1 腸道目的菌群RT-PCR反應(yīng)所需引物及退火溫度

2.4 肝硬化小鼠血清炎性因子的變化

隨著肝硬化進(jìn)程的加重，小鼠血液中內(nèi)毒素（ET）及炎性因子（IL-1、IL-6、TNF-α）的水平顯著提高（表2）。在造模第8周，肝細(xì)胞水腫壞死嚴(yán)重，并伴有炎性細(xì)胞的浸潤，肝臟代謝能力受損嚴(yán)重，此時(shí)，血液內(nèi)毒素及炎性因子的水平顯著增高。

3 討論

肝硬化可由一種或多種病因長期作用而造成彌漫性肝臟損害，肝細(xì)胞變性、壞死、再生，纖維組織增生，最終導(dǎo)致肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，假小葉形成?？砂殡S有腹水、黃疸、肝昏迷等。

要深入研究肝硬化的發(fā)病機(jī)制及預(yù)后，必須建立較為理想的肝纖維化動物模型。目前常用的肝硬化造模方法有CCl4法、二甲基亞硝胺（DMN）法、D2-半乳糖胺法、膽管阻塞法、免疫法、營養(yǎng)不良法、乙醇法等。傳統(tǒng)的CCl4造模方法包括灌胃、皮下注射和腹腔注射，本研究采用的灌胃注射是一種具有較高成功率及較低意外致死率的方法。造模時(shí)間依給藥途徑和劑量而不同，通常為12～16周。CCl4誘導(dǎo)小鼠肝臟纖維化是一種比較典型的肝硬化模型，在形態(tài)學(xué)及病理生理學(xué)方面與人的肝纖維化相似度最高，如均具有肝細(xì)胞壞死后的再生、中央靜脈壁和匯管區(qū)的血管壁周圍有明顯纖維增生、形成纖維化等，而且造模簡單，已被廣泛應(yīng)用。

擬桿菌屬為腸道中嚴(yán)格厭氧革蘭陽性細(xì)菌，是腸道菌膜屏障的一部分。肝硬化小鼠腸道中擬桿菌屬細(xì)菌顯著減少，從而為條件致病菌的侵襲和定殖提供了機(jī)會。肝硬化小鼠腸道中顯著增加的韋榮球菌屬、腸桿菌屬和腸球菌屬均為革蘭陰性細(xì)菌，可以產(chǎn)生內(nèi)毒素。由于正常肝臟Kupffer細(xì)胞的清除功能，內(nèi)毒素在血液中的含量極其微弱，小于0.1 EU/mL，不會形成內(nèi)毒素血癥；而對于肝硬化小鼠來說，由于肝臟清除功能降低，肝硬化引起的門脈高壓進(jìn)一步導(dǎo)致腸壁水腫，通透性增加，這些因素共同作用，導(dǎo)致內(nèi)毒素入血增加。一方面，內(nèi)毒素可以誘導(dǎo)一些細(xì)胞因子（TNF、IL-1和IL-6）的分泌，已有文獻(xiàn)表明，這些細(xì)胞因子會引起細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解異常，從而促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)程[7]。Li等[8]研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者腸道中腸桿菌科的水平與血內(nèi)毒素水平呈正相關(guān)。另一方面，腸道中韋榮球菌屬、腸桿菌屬和腸球菌屬過度繁殖，其產(chǎn)生的過量內(nèi)毒素會抑制腸上皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，因此腸壁屏障受損，進(jìn)一步威脅腸道微環(huán)境，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，從而形成惡性循環(huán)。以上結(jié)論可用圖3概括。由此可見，腸道菌群對肝硬化的預(yù)后有很大的影響，未來有希望通過改善腸道菌群結(jié)構(gòu)來促進(jìn)肝硬化患者的預(yù)后，改善其生活質(zhì)量。

圖2 肝硬化小鼠腸道目的菌群RT-PCR檢測結(jié)果

表2 肝硬化進(jìn)程中小鼠血液內(nèi)毒素及炎性因子水平的變化（x±s）

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