HPLC－ELSD法測定珠子參根莖中新化合物24（R）－珠子參苷R1 的質(zhì)量比

王加付，彭 紹，李蘭杰，楊 潔，孫 婷，李緒文，金永日，時曉磊，3

（1.吉林大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，長春130012；2.黑龍江煙草有限責(zé)任公司，哈爾濱150001；3.吉林大學(xué) 軍需科技學(xué)院，長春130062）

珠子參為五加科植物珠子參（Panax japonicus C.A.Mey.var.Major（Burk.）C.Y.Wu et K.M.Feng）的干燥根狀莖，具有補(bǔ)肺、養(yǎng)陰、活絡(luò)和止血的作用，用于治療氣陰兩虛、煩熱口渴、虛勞咳嗽、跌撲損傷、關(guān)節(jié)疼痛、咳血、吐血和外傷出血等癥.珠子參廣泛分布于云南、貴州、湖北和四川等地［1］，生長于陰濕的針闊葉林、闊葉灌木、竹葉林以及雜灌叢中.目前，珠子參根莖的化學(xué)成分［2－5］和藥理作用［6－9］研究較多，其化學(xué)成分測定［10－11］主要集中在質(zhì)量濃度較大的皂苷竹節(jié)參皂苷Ⅳa和竹節(jié)參皂苷Ⅴ.本文采用高效液相色譜蒸發(fā)光散射法（HPLC－ELSD）測定珠子參根莖中新化合物24（R）－珠子參苷 R1的質(zhì)量比［12］.

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

珠子參分別購于云南省昆明市和河北省安國市，經(jīng)吉林大學(xué)藥學(xué)院張靜敏教授鑒定為珠子參的干燥根莖；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水；甲醇為色譜純；化合物24（R）－珠子參苷R1對照品自制，經(jīng)質(zhì)譜（MS）、紅外光譜（IR）、核磁共振氫譜（1H NMR）和核磁共振碳譜（13C NMR）等方法表征樣品結(jié)構(gòu)，按HPLC－ELSD色譜條件歸一化測定樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.85%，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示.

圖1 化合物24（R）－珠子參苷R1的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of 24（R）－majoroside R1

1.2 儀 器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Alltech 2000型蒸發(fā)光散射檢驗(yàn)器（美國Alltech公司）；RE－201C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市英峪予華儀器廠）；Mettlertoledo AG135型電子天平（德國Startorius YDO－OIR公司）；KQ－250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）.

1.3 對照品的分離純化

將珠子參根莖80%的乙醇粗提取物（約1.4kg）用洗脫劑V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）∶V（水）＝20∶1∶0.05進(jìn)行硅膠柱層析.經(jīng)薄層色譜（TLC）檢測可得A，B，C，D 4個極性不同的部分.將B部分用洗脫劑V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）∶V（水）＝10∶1∶0.05進(jìn)一步硅膠柱純化、合并并濃縮，得到B1和B2兩部分.將B1部分用V（甲醇）∶V（水）＝1.5的溶劑進(jìn)行ODS柱層析，分離得到對照品70mg.

1.4 對照品溶液的配制

稱量對照品約10.12mg，置于10.00mL容量瓶中，以甲醇溶解、定容，得1.00mg／mL對照品儲備液.將2.0mL儲備液置于10.00mL容量瓶中，用甲醇定容，得0.2mg／mL對照品溶液.

1.5 供試品溶液的制備

將干燥的珠子參粉碎，過60目篩，精密稱取2.0g，用16mL甲醇作為提取溶劑，連續(xù)回流3次，回流時間依次為1.5，1.0，1.0h，合并提取液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，以甲醇溶解，并定容至10.00mL，過0.22μm有機(jī)濾膜，取續(xù)濾液.

1.6 色譜條件

Aglilent Zorbax SB－C18（ODS，4.6mm×250mm，5μm）色譜柱；流動相為甲醇和水，等度洗脫，體積比為58∶42；流速為1.0mL／min；柱溫為25℃；載氣壓力為1.94×105Pa；漂移管溫度為85℃；撞擊器關(guān)閉；進(jìn)樣量為20μL.將對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.2mg／mL）和供試品溶液各20μL置于高效液相色譜儀進(jìn)行測定.

2 條件優(yōu)化

2.1 ELSD條件選擇

經(jīng)紫外光譜測定，24（R）－珠子參苷R1在200～400nm無吸收，因此選擇ELSD作為檢測器.對ELSD的檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，確定其條件為：載氣壓力1.94×105Pa；漂移管溫度85℃；撞擊器關(guān)閉.

2.2 流動相選擇

采用不同體積比的甲醇和水及乙腈和水作為流動相，通過比較色譜可見：采用乙腈和水作為流動相，待測化合物與樣品中的其他化合物無法達(dá)到基線分離；采用V（甲醇）∶V（水）＝58∶42作為流動相可使混合物達(dá)到較好的分離效果（分離度＞1.5），且保留時間為14.2min，因此采用V（甲醇）∶V（水）＝58∶42作為流動相.

2.3 提取條件的選擇

2.3.1 提取溶劑選擇 將干燥的珠子參粉碎，過60目篩，稱取2.0g，分別選乙酸乙酯、乙醇、體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇及甲醇為提取溶劑，連續(xù)回流3次，合并、濃縮提取液，置于10.00mL容量瓶中，分別用色譜甲醇溶解、定容，過0.22μm有機(jī)濾膜，取20μL續(xù)濾液置于高效液相色譜儀進(jìn)行測定，結(jié)果列于表1.由表1可見，甲醇的提取效率最高，乙酸乙酯的提取效率最低，因此選擇甲醇作為提取溶劑.

表1 不同提取溶劑所得24（R）－珠子參苷R1的峰面積Table 1 Peak areas of 24（R）－majoroside R1extracted by different extraction solvents

2.3.2 提取溶劑用量選擇 將干燥的珠子參粉碎，過60目篩，精密稱取2.0g，將甲醇作為提取溶劑，考察每次提取用量為12，16，20mL時對待測物峰面積的影響，通過加熱回流的方式提取3次，分別用色譜甲醇定容至10.00mL，過0.22μm有機(jī)濾膜，取20μL續(xù)濾液置于高效液相色譜儀測定.結(jié)果列于表2.由表2可見，當(dāng)甲醇用量為16mL時，所得待測物的峰面積較大，因此甲醇的用量為16mL.

表2 提取溶劑不同用量所得24（R）－珠子參苷R1的峰面積Table 2 Peak area of 24（R）－majoroside R1extracted at different solvent volumes

2.3.3 提取次數(shù)的確定 將2.3.2中提取過3次的樣品，繼續(xù)提取1h，按1.5方法進(jìn)行處理，經(jīng)HPLC－ELSD測定，沒有待測物檢出，故提取次數(shù)確定為3次.

綜上，確定提取條件為：將干燥的珠子參粉碎，過60目篩，精密稱取2.0g，分別用16mL甲醇連續(xù)回流3次，回流時間依次為1.5，1.0，1.0h，合并、濃縮提取液，以甲醇溶解，并定容至10.00mL.最佳條件下提取的24（R）－珠子參苷R1對照品和樣品的色譜如圖2所示.

圖2 24（R）－珠子參苷R1 對照品（A）和珠子參樣品（B）的色譜Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances（A）and sample（B）of 24（R）－majoroside R1

3 方法與結(jié)果

3.1 線性關(guān)系考察

按照1.4方法制備1.00mg／mL對照品儲備液，精密移取0.20，0.50，1.00，2.00，5.00mL儲備液分別置于10.00mL容量瓶中，加色譜甲醇定容，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液及對照品儲備液20μL置于高效液相色譜儀，平行測定3次，取平均值；以對照品進(jìn)樣量的lg m值為x軸、對照品峰面積的lg S值為y軸做標(biāo)準(zhǔn)曲線，24（R）－珠子參苷R1的回歸方程為

其線性范圍為0.40～20.0μg.

3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

將質(zhì)量濃度為0.1，0.2，0.5mg／mL的對照品溶液各20μL置于高效液相色譜儀中，分別連續(xù)進(jìn)樣6次（日內(nèi)精密度），測得24（R）－珠子參苷R1峰面積的RSD值分別為0.27%，0.52%和0.17%.連續(xù)進(jìn)樣3d，每天進(jìn)樣2次（日間精密度），測得24（R）－珠子參苷R1峰面積的RSD值分別為1.37%，1.61%和1.18%.

3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按1.5方法操作，制得6份供試品溶液，分別吸取20μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定，結(jié)果表明，24（R）－珠子參苷R1質(zhì)量濃度的RSD＝0.96%（n＝6）.

3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按1.5方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10h按上述色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果表明，24（R）－珠子參苷R1峰面積的RSD為1.71%，供試品在10h內(nèi)完成測定即可.

3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

將干燥的珠子參樣品粉碎，過60目篩，精密稱取2.0g（化合物24（R）－珠子參苷R1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.045 3%），共6份，每份均加入0.9mg的對照品，按1.5方法制備6份加標(biāo)供試品溶液.對其質(zhì)量濃度進(jìn)行測定，測得24（R）－珠子參苷R1的平均回收率為98.7%，其RSD＝1.28%（n＝6）.

3.6 樣品的測定

將分別購于河北省安國市和云南省昆明市的珠子參樣品按1.5方法進(jìn)行處理，分別取質(zhì)量濃度為0.2mg／mL的對照品溶液及2份樣品溶液各20μL置于高效液相色譜儀中，分別連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積，測得河北省安國市和云南省昆明市的珠子參根莖中24（R）－珠子參苷R1的質(zhì)量比分別為3.06mg／g和0.45mg／g.

綜上，本文采用HPLC－ELSD方法測定了不同產(chǎn)地珠子參根莖中新化合物24（R）－珠子參苷R1的質(zhì)量比，并對其方法學(xué)進(jìn)行了考察.結(jié)果表明，該方法可準(zhǔn)確、快速測定珠子參中24（R）－珠子參苷R1的質(zhì)量比，重復(fù)性及回收率較好，方法可靠.

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