香菇多糖對小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞表型和功能的影響

胡婷婷，孟一鳴，單風(fēng)平

(中國醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110001)

香菇多糖(Lentinan，LNT)是香菇子實(shí)體提取物中的主要有效成分之一，是1969年 Chihara等［1］首次從香菇中分離出的具有抗腫瘤活性的多糖。研究發(fā)現(xiàn)，LNT具有多種藥理學(xué)作用，是一種兼有抑制腫瘤和提高免疫功能的多糖類生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑［2］。LNT可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，激活T淋巴細(xì)胞釋放活化因子，提高NK細(xì)胞活性，誘導(dǎo)干擾素或白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子的產(chǎn)生［3］。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)，具有獨(dú)特的抗原遞呈和激活功能;作為免疫反應(yīng)的核心和關(guān)鍵，在腫瘤細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的相互作用中起橋梁和樞紐作用［4］。本研究利用LNT作用于小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞(bone marrow dendritic cells，BMDCs)，進(jìn)一步觀察 LNT的免疫活性及其對DCs的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性C57BL/6小鼠，6～8周，購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 藥物和主要試劑 香菇多糖(商品名為天地欣)購自南京綠葉思科藥業(yè)有限公司;IL-12、IL-10和 TNF-α ELISA 試劑盒(eBioscience)，MHCⅡ抗體、CD40抗體、CD83抗體、CD86抗體、CD80抗體和DEC205抗體(BD Biosciences)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng) 取6～8周齡C57BL/6小鼠，頸椎脫臼處死，于75%酒精中浸泡10～15 min，無菌手術(shù)取出四肢放入75%酒精中，剔去肌肉，剪掉骨頭兩端，用1 mL無菌注射器吸取RPMI1640反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液，1500 r/min離心6 min，倒掉上清，加入1～2 mL紅細(xì)胞裂解液1～2 min，用PBS洗3遍后重懸于含雙抗和10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)液中，接種于6孔板，24 h后棄去未貼壁細(xì)胞，再加入含 GM-CSF、IL-4、雙抗和10%FCS的RPMI1640，每隔1 d取出半量培養(yǎng)液再加入等量的含 GM-CSF、IL-4、雙抗和 10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)至對數(shù)期，加藥刺激。

1.2.2 藥物處理 LNT溶解于RPMIl640中，使LNT濃度為50 μg/mL，然后加入培養(yǎng)至對數(shù)生長期的BMDCs細(xì)胞培養(yǎng)液中，用RPMI1640培養(yǎng)作為空白對照組，10 ng/mL的LPS(Sigma)刺激培養(yǎng)作為陽性對照。

1.2.3 酸性磷酸酶活性檢測 BMDCs經(jīng)藥物處理后培養(yǎng)48 h，再用胰酶消化成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，按照酸性磷酸酶試劑盒(南方建成生物工程研究所)提供方法操作。

1.2.4 免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞儀檢測 BMDCs經(jīng)藥物作用48 h后，用胰酶消化為細(xì)胞懸液，用FACS緩沖液(含2%FCS的PBS)洗1次，1500 r/min離心6 min，調(diào)整細(xì)胞濃度1×106個(gè)/mL，每管加0.1 mL細(xì)胞懸液，加 PE標(biāo)記的 MHCⅡ和CD40，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的 CD83、CD86、CD80 和 DEC205單克隆抗體，4℃避光溫育30 min，用FACS緩沖液洗3遍，然后用300 μL FACS緩沖液重懸細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀(FACScan B.D.)檢測。

1.2.5 吞噬試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)過程要求無菌操作，細(xì)胞處理步驟同 1.2.4，加入 FITC-dextran抗體，4℃避光溫育2 h，37℃避光溫育1 h，用FACS緩沖液洗3遍，然后用300 μL FACS緩沖液重懸細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀(FACScan B.D.)檢測。

1.2.6 細(xì)胞因子檢測 BMDCs經(jīng)藥物作用48 h后收集上清，應(yīng)用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-12、IL-10和TNF-α的含量，試驗(yàn)按照購買的ELISA試劑盒的步驟操作。反應(yīng)終止后用酶標(biāo)儀檢測450 nm吸光值(A450)，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定所測細(xì)胞因子的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 LNT對酸性磷酸酶活性的影響

BMDCs經(jīng)藥物L(fēng)NT刺激培養(yǎng)48 h后，檢測酸性磷酸酶活性。50 μg/mL的 LNT((78.73±3.14)U/gpmt)和 LPS((65.66 ±1.07)U/gpmt)組與 RPMI1640((94.18 ±1.35)U/gpmt)對照組相比酸性磷酸酶活性下降(P＜0.01)，見圖1。

圖1 LNT下調(diào)BMDCs酸性磷酸酶活性Fig.1 LNT depress the activity of acid phosphatase of BMDCs

2.2 LNT 對 DC MHCⅡ、CD40、CD83、CD80、CD86和DEC205表達(dá)的影響

BMDCs經(jīng)藥物L(fēng)NT刺激培養(yǎng)48 h后，流式細(xì)胞儀檢測 DC 表面 MHCⅡ、CD40、CD83、CD80、CD86和DEC205的表達(dá)情況見圖2。表明50 μg/mL 的 LNT 能夠上調(diào) MHCⅡ、CD40、CD83、CD80、CD86 和 DEC205 的表達(dá)(P ＜0.01)，即50 μg/mL的LNT能夠促進(jìn)DC表型的成熟。

圖2 LNT能夠上調(diào)BMDCs表面 MHCⅡ、CD40、CD83、CD80、CD86和DEC205的表達(dá)Fig.2 LNT enhance the expression of MHCⅡ，CD40，CD83，CD80，CD86 and DEC205 molecules on the BMDCs surface

2.3 LNT抑制DC對FITC-dextran的吞噬

BMDCs經(jīng)藥物L(fēng)NT刺激培養(yǎng)48 h后，再加入FITC-dextran后4℃避光溫育2 h，再37℃避光溫育1 h，在流式細(xì)胞儀上檢測陽性細(xì)胞的百分比，以此百分比代表DC吞噬FITC-dextran的量，反映DC攝取抗原的能力。經(jīng)過LNT和LPS處理過的DC陽性細(xì)胞所占比例分別是(46.86±5.99)%和(43.53 ±6.29)%，比空白對照組(即RPMI1640組)的(59.82±1.67)%明顯降低(P ＜0.05)(見圖 3)。

2.4 LNT 對 DC 分泌 IL-12、IL-10 和 TNF-α 的影響

ELISA結(jié)果顯示 DC的空白對照(即 RPMI1640組)IL-12、IL-10和 TNF-α分泌的量少((33.34 ± 2.61)、(99.75 ± 6.74)、(553.69 ±16.29)pg/mL)，50 μg/mL 的 LNT 和 LPS處理的DC能夠分泌高水平的IL-12、IL-10和TNF-α(LNT、LPS 分別為(143.53 ± 20.98)、(496.2 ±17.99)pg/mL;(196.23 ± 2.93)、(437.21 ±13.21)pg/mL;(706.54 ± 13.79)、(835.56 ±21.47)pg/mL，(P ＜0.01))，見圖4。

圖3 LNT和LPS處理的DC吞噬功能比RPMI1640(即空白對照組)明顯降低Fig.3 The ability of unstimulated BMDCs to uptake FITC-dextran was higher than that of LNT-or LPS-treated BMDCs

圖4 LNT能夠增強(qiáng)BMDCs對IL-12、IL-10和TNF-α的分泌Fig.4 LNT-treated BMDCs secreted higher level of IL-12，IL-10 and TNF-α

3 討論

LNT具有多種藥理學(xué)作用，可有效激活T細(xì)胞，增強(qiáng)腫瘤患者 Th和 Tc細(xì)胞的功能［5］，激活腫瘤壞死因子的產(chǎn)生及巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，間接殺滅腫瘤細(xì)胞［6］。DCs是目前人體內(nèi)最活躍、功能最強(qiáng)大的專職抗原呈遞細(xì)胞，參與機(jī)體多種自身免疫性疾病、免疫缺陷病、腫瘤及一些炎癥反應(yīng)的病理過程，在機(jī)體的抗感染免疫及腫瘤免疫應(yīng)答過程中起著極其重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)研究了濃度為50 μg/mL的LNT對小鼠骨髓來源的DCs表型和功能的影響。研究結(jié)果顯示，50 μg/mL LNT刺激培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞高表達(dá) MHCⅡ、CD40、CD83、CD80、CD86 和DEC205分子。成熟DCs高表達(dá) MHCⅡ、CD40、CD86和CD80等共刺激分子，CD83是DCs成熟的特征性標(biāo)志［7］，DEC205是C型凝集素巨噬細(xì)胞甘露糖受體家族成員，在淋巴結(jié)T細(xì)胞區(qū)的DCs上高表達(dá)［8］，能高效地將抗原加載到 MHCⅡ分子上并提呈給T淋巴細(xì)胞［9］，而且細(xì)胞對FITC-dextran的吞噬能力下降，細(xì)胞趨向成熟;此外，還發(fā)現(xiàn)50 μg/mL LNT可使細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶活性下降，酸性磷酸酶是溶酶體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)消化的標(biāo)示酶，其活性下降，說明細(xì)胞溶酶體含量減少，間接說明DCs吞噬抗原的能力減弱，細(xì)胞趨向成熟。IL-12和IL-10是DCs的自分泌細(xì)胞因子［10］，在受到細(xì)菌、病毒或其自身表面分子配體的刺激下分泌更明顯。IL-12有強(qiáng)大的誘生干擾素的作用，故DCs可通過IL-12介導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答，其含量的增加可進(jìn)一步促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)殺傷活性，刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生 IFN-γ，抑制 IgE合成［11］。內(nèi)源性及外源性IL-10可影響DCs指導(dǎo)Th1/Th2極化，誘導(dǎo)無能/調(diào)節(jié)T細(xì)胞，有助于DCs誘導(dǎo)Th2反應(yīng)［12］。TNF-α可誘導(dǎo)IFN的產(chǎn)生，與IFN具有協(xié)同抗病毒作用，TNF-α具有抗腫瘤、促進(jìn) T、B細(xì)胞生長等多種生物學(xué)活性［13］。IL-12、IL-10和TNF-α 是 mDC 的功能性產(chǎn)物［10，14］，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示其含量的增高及DCs抗原提呈方面的成熟和表型上的成熟是對應(yīng)的。

機(jī)體抗腫瘤免疫主要依靠CTL的免疫應(yīng)答來殺傷腫瘤細(xì)胞，CTL并不能識(shí)別完整的腫瘤抗原分子，只能特異性地識(shí)別由MHC分子呈遞的抗原多肽。在大部分惡性腫瘤中，腫瘤細(xì)胞表面的MHC抗原肽、共刺激分子和黏附分子表達(dá)較低，不能有效地誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，故需要抗原呈遞細(xì)胞的協(xié)同作用［15］，然而功能最強(qiáng)大的專職抗原呈遞細(xì)胞DCs在腫瘤組織及其周圍只有很少的浸潤［16］。所以，DCs疫苗治療腫瘤是一種安全的、有效誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)的免疫療法，諸多試驗(yàn)也取得了一些療效［17-19］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LNT能夠促進(jìn)DCs的成熟，提高DCs的抗原提呈能力，刺激DCs高表達(dá)共刺激分子，使IL-12、IL-10和 TNF-α等因子分泌量增加，抑制腫瘤的生長。因此，LNT作為DCs治療腫瘤的免疫佐劑具有重要的臨床意義，其在體內(nèi)對DCs的影響等也值得深入研究。

［1］Chihara G，Maeda Y，Hamuro J，et al.Inhibition of Mouse Sarcoma 180 by Polysaeeharides from LentinusEdodes(Berk)Sing［J］.Nature，1969，222(5194):687-688.

［2］Bisen PS，Baghel RK，Sanodiya BS，et al.Lentinus edodes:A Macrofungus with Pharmacological Activities［J］.Curr Med Chem，2010，17(22):2419-2430.

［3］Xu X，Wang X，Cai F，et al.Renaturation of triple helical polysaccharide lentinan in water-diluted dimethylsulfoxide solution［J］.Carbohydr Res，2010，345(3):419-424.

［4］Xue M，Zhu L，Meng Y，et al.Detailed modulation of phenotypes and functions of bone marrow dendritic cells(BMDCs)by interferon-gamma(IFN-γ)［J］.Int Immunopharmacol，2013，17(2):366-372.

［5］汪繼斌，謝毅強(qiáng)，吳賢波.香菇多糖對約氏瘧原蟲感染小鼠樹突狀細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2013，8(1):56-58.

［6］叢陽，黃敏.香菇多糖抗腫瘤的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32(4):465-469.

［7］Meng Y，Plotnikoff NP，Shan F，et al.Synergistic effect of methionine encephalin(MENK)combined with pidotimod(PTD)on the maturation of murine dendritic cells(DCs)［J］.Hum Vaccin Immunother，2013，9(4):773-783.

［8］Thonur L，Haig DM，Thomson J，et al.Toll-like receptor gene expression in fresh and archived ovine pseudoafferent lymph DEC205+dendritic cells［J］.J Comp Pathol，2012，147(2-3):296-304.

［9］Cheong C，Choi JH，Vitale L，et al.Improved cellular and humoral immune responses in vivo following targeting of HIV Gag to dendritic cells within human anti-human DEC205 monoclonal antibody［J］.Blood，2010，116(19):3828-3838.

［10］Sabado RL，Miller E，Spadaccia M，et al.Preparation of tumor antigen-loaded mature dendritic cells for immunotherapy［J］.J Vis Exp，2013，1:78.

［11］Darlak KA，Wang Y，Li JM，et al.Enrichment of IL-12-producing plasmacytoid dendritic cells in donor bone marrow grafts enhances graft-versus-leukemia activity in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2013，19(9):1331-1339.

［12］Huang H，Dawicki W，Lu M，et al.Regulatory dendritic cell expression of MHCII and IL-10 are jointly requisite for induction of tolerance in a murine model of OVA-asthma［J］.Allergy，2013 ，68(9):1126-1135.

［13］Miwa S，Nishida H，Tanzawa Y，et al.Correction:TNF-α and Tumor Lysate Promote the Maturation of Dendritic Cells for Immunotherapy for Advanced Malignant Bone and Soft Tissue Tumors［J］.PLoS One，2013，24:8(10).

［14］Matsuda R，Kezuka T，Nishiyama C，et al.Suppression of murine experimental autoimmune optic neuritis by mature dendritic cells transfected with calcitonin gene-related Peptide gene［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2012，53(9):5475-5485.

［15］Kim DS，Kim DH，Goo B，et al.Immunotherapy of malignant melanoma with tumor lysate-pulsed autologous monocyte-derived dendritic cells［J］.Yonsei Med J，2011，52(6):990-998.

［16］Ayari C，LaRue H，Hovington H，et al.High level of maturetumor-infiltrating dendritic cells predicts progression to muscle invasion in bladder cancer［J］.Hum Pathol，2013，44(8):1630-1637.

［17］Perroud MW Jr，Honma HN，Barbeiro AS，et al.Mature antolognus dendritic cell vaccines in advanced non-small cell lung caneer:a phase I pilot study［J］.Exp Clin Cancer Res，2011，30:65.

［18］Kvisthorg P，Beehmann CM，Pedersen AW，et al.Comparison of monocyte-derived dendritic cells from colorectal cancer patients，non-small-cell-lung-cancer patients and healthy donors［J］.Vaccine，2010，28(2):542-547.

［19］Fukushima S，Himta S，Motomura Y，et al.Multiple antigentarged immunotherapy with alpha-galactosylce-ramide-loaded and genetically engineered dendritic cells derived from embryonic stem cells［J］.Immunother，2009，32(3):219-231.