實時熒光PCR在治理石油污染中的應(yīng)用

喻 嬋，姚 俊

(北京科技大學(xué)土木與環(huán)境工程學(xué)院環(huán)境與能源國際合作基地，北京 100083)

石油烴類化合物是環(huán)境中普遍存在的一類污染物［1-4］，主要元素包括 C、H、O、N、P，是由烷烴、芳香烴、膠質(zhì)及瀝青組成的混合物。在石油的開采、加工、運輸、處理等過程中常伴隨有石油的泄漏，造成嚴(yán)重的石油污染［5］。治理石油污染的方法很多，主要包括物理方法、化學(xué)方法和生物方法［6］，而生物方法以其操作簡單、價格低廉及環(huán)境友好等優(yōu)點逐漸成為目前的研究熱點。同時，生物方法被認(rèn)為是自然的、綠色的解決方案，能夠加速石油污染物的降解，最大限度的減少生態(tài)效應(yīng)問題［7］。近年來，越來越多的能夠降解石油烴類化合物的微生物菌株被篩選鑒定出來［8-9］，而研究菌株降解石油烴類化合物的代謝途徑及降解過程中的功能基因為更好地了解它們的降解機(jī)制奠定了基礎(chǔ)［10］。功能基因是控制物種的特定功能，并且其表達(dá)可能影響微生物本身活性的基因。在沒有受到外界影響的情況下，相同種屬物種中某個基因的表達(dá)量應(yīng)該是相同的［11］。RT-PCR技術(shù)能夠被用來檢測基因的表達(dá)［12-13］。本文從大港油田原油樣品中篩選獲得12株能夠降解原油的菌株，并對它們的降解特性進(jìn)行了測定。對其中被命名為BS的1株對原油降解效果最好的菌株的代謝途徑進(jìn)行了分析，進(jìn)一步利用RT-PCR技術(shù)對alkB基因的表達(dá)量進(jìn)行了檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 原油樣品采集自大港油田港西區(qū)塊58-8-3號油井;標(biāo)準(zhǔn)菌株Bacillus subtilis BS5由北京科技大學(xué)生物化學(xué)學(xué)院提供［14］。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) LB培養(yǎng)基:酵母粉5，胰蛋白胨 10，NaCl 10，pH 7.0;無機(jī)鹽培養(yǎng)基［15］:CoCl2·6H2O 0.366，KH2PO40.5，(NH4)2SO43.0，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.05，Na2HPO4·12H2O 1.26，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03，MgSO4·7H2O 0.54，ZnSO4·7H2O 0.024，MnSO4·H2O 0.015，pH 7.2 ～7.4。添加2%的瓊脂制成固體培養(yǎng)基，121℃，滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌種篩選 將原油樣品以2%的接種量接種于50 mL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，28℃好氧條件下180 r/min搖床培養(yǎng)7 d，相同條件下轉(zhuǎn)接1次。然后采用稀釋涂平板法分別涂于以十六烷、甲苯、萘、菲等為唯一碳源的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫箱培養(yǎng)7 d形成單菌落。挑取邊緣整齊、生長迅速的菌落接入無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，搖瓶復(fù)篩，得到12株目的菌株。

1.2.2 菌株降解特性的測定 石油在紫外光區(qū)的特征吸收波長為227 nm。分別配制1.8×10－3～5.4 ×10－3的系列標(biāo)準(zhǔn)原油樣品，用 1 cm 的石英比色皿，以正己烷為對照，依次測定上述系列樣品的吸光度，得到降解率與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)方程，利用該方程得到各菌株的降解率。

標(biāo)準(zhǔn)方程:y=－0.00003x+2.340(R2=0.974)，其中y表示吸光度，x表示樣品稀釋度，R2表示相關(guān)系數(shù)。

1.2.3 菌株的鑒定 篩選出對石油降解效果最好的菌株BS在28℃、LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取1.5 mL培養(yǎng)液，12000 r/min離心，收集菌體。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行該菌株總DNA。提取后的總DNA置于－20℃保存，備用。以總DNA為模版，正、反向引物分別為27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL，其中總 DNA 0.5 μL，PCR mix 10 μL，正、反引物各 0.4 μL，ddH2O 8.7 μL;PCR 的擴(kuò)增程序:94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 90 s，72 ℃ 10 min，35個循環(huán)。華大基因公司進(jìn)行16S rDNA序列的測定，測序結(jié)果在GenBank上與已知種屬的16S rDNA進(jìn)行BLAST比對，利用MEGA4構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 分析B.subtilis BSn5菌株的代謝途徑SEED軟件可被用來整合分析物種的代謝途徑［16-17］。利用該軟件不僅能夠構(gòu)建所有基因組已完成測序的物種的代謝途徑，還能通過該軟件找到編碼某種酶的基因和此基因催化的代謝途徑，比如降解石油烴類化合物的基因及催化途徑。

1.2.5 RT-PCR 對 alkB基因的測定 alkB基因在石油降解的代謝途徑中起重要作用，利用RT-PCR技術(shù)研究該基因經(jīng)石油污染后表達(dá)量的變化，能夠進(jìn)一步了解微生物降解石油烴的機(jī)制。提取菌株BS和標(biāo)準(zhǔn)菌株B.stubilis BSn5的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株對石油烴類化合物的降解

從原油樣品中篩選得到的12株菌是嚴(yán)格的好氧菌株，屬于假單胞桿菌屬、金黃色葡萄球菌屬、芽胞桿菌屬、紅球菌屬和不動桿菌屬。早期的報道指出，這些屬的菌株在對烴類化合物、多環(huán)族化合物以及它們的衍生物的降解過程中有重要作用。12株菌對原油的降解如圖1所示。

圖1 12株菌對石油的降解率Fig.1 The oil degradation efficiency of the twelve strains

由圖1可見，12株菌對原油的降解能力各不相同，其中Y8對原油的降解效果最好，降解率高達(dá)89.1%。由此推測，在此菌株中可能存在一些功能基因，而這些功能基因?qū)κ徒到馔緩接兄匾饔?，?dāng)它們過量表達(dá)時，能夠更加高效地降解原油。

2.2 菌株的鑒定

將對石油降解效果最好的菌株Y8命名為BS，利用16S rDNA測序，獲得的同源性序列均為芽胞桿菌屬的16S rDNA序列，其中與B.stubilis BSn5的同源性高達(dá)100%，被認(rèn)為是同種菌株。菌株BS與標(biāo)準(zhǔn)菌株B.stubilis BSn5的基因在同一時刻的表達(dá)量是相同的。進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定該菌株在所屬種屬中的親緣關(guān)系，如圖2所示。從建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，菌株BS屬于芽胞桿菌屬，與枯草芽胞桿菌、甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌等親緣關(guān)系都較近。

圖2 菌株BS的系統(tǒng)進(jìn)化地位Fig.2 The strain BS on 16S rRNA analysis

2.3 分析B.stubilis BSn5菌株的代謝途徑

利用SEED軟件重構(gòu)B.stubilis BSn5的代謝途徑圖，分析該菌株中參與石油烴類化合物降解的功能基因，如圖3所示。

圖3 B.stubilis菌株BSn5的亞系統(tǒng)分析Fig.3 The subsystem statistics of Bacillus stubilis BSn5

圖3中顯示出利用SEED軟件構(gòu)建出的B.stubilis BSn5菌株的整個亞系統(tǒng)分布圖，在該菌的所有的編碼基因中，有2048個基因參與這個亞系統(tǒng)，而另外2182個基因不參與此系統(tǒng)。利用這個軟件重構(gòu)的代謝途徑中，可以找到菌株B.stubilis BSn5參與各類代謝途徑的基因比例、基因編碼的相關(guān)酶以及酶催化的代謝途徑。從圖3可以看出，菌株B.stubilis BSn5中有11個功能基因參與石油烴類化合物降解的代謝途徑，本研究選擇alkB基因測定其在經(jīng)石油污染后表達(dá)量的變化。

2.4 RT-PCR測定alkB基因的表達(dá)

利用RT-PCR的方法定量了菌株BS和標(biāo)準(zhǔn)菌株B.stubilis BSn5的alkB基因的表達(dá)量，以16S核糖體基因為參照基因，結(jié)果見圖4。

圖4 RT-PCR測定alkB基因在菌株BS和B.subtilis BSn5的表達(dá)Fig.4 RT-PCR of alkB expression in BS and in B.subtilis BSn5

從圖4可以看出，篩選到的菌株BS較標(biāo)準(zhǔn)菌株B.subtilis BSn5的編碼alkB基因過量表達(dá)了約2倍，該酶被認(rèn)為在降解原油組分的代謝途徑中有重要作用，而作為內(nèi)參基因的16S核糖體基因的表達(dá)量沒有發(fā)生變化，說明菌株BS在石油污染脅迫條件下能夠降解原油組分的有關(guān)基因的表達(dá)量上調(diào)，可能對降解原油組分有作用。

3 討論

自大港油田港西區(qū)塊58-8-3號油井原油樣品中篩選得到12株能夠降解原油的菌株細(xì)菌，經(jīng)鑒定屬于假單胞桿菌屬、金黃色葡萄球菌屬、芽胞桿菌屬、紅球菌屬和不動桿菌屬，均屬于嚴(yán)格好氧型。對其降解特性進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，12株菌株對原油的降解能力各不相同，其中菌株BS對原油的降解效果最好，降解率高達(dá)89.1%。進(jìn)一步對菌株BS中alkB基因的表達(dá)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，較標(biāo)準(zhǔn)菌株B.subtilis BSn5的編碼alkB基因過量表達(dá)了約2倍，該酶被認(rèn)為在降解原油組分的代謝途徑中有重要作用，說明菌株BS在石油污染脅迫條件下能夠降解原油組分的有關(guān)基因的表達(dá)量上調(diào)，可能對降解原油組分有作用。本研究為檢測和分析石油污染、篩選含有降解石油功能基因的微生物及構(gòu)建工程菌提供了新的手段。

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