脫氫乙酸小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗

李佳常，杜玉峰，史玉靜

(1.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210009;2.重慶市北碚區(qū)農(nóng)業(yè)委員會，重慶400700)

脫氫乙酸(Dehydroacetic Acid，簡稱 DHA)，CAS號:520－45－6，分子式為 C8H8O4，分子量為168.15，按系統(tǒng)命名法為3－乙?；?－甲基－二氫吡喃－2，4－(3H)－二酮(3－acetyl－4－h(huán)ydroxy－6－methyl－2－pyrone)，結(jié)構(gòu)式見圖1。

DHA作為一種廣譜防腐劑，被廣泛應(yīng)用于乳制品、餅干、面包、魚肉制品、飲料、果蔬、泡菜、醬菜等食品的防腐保鮮。現(xiàn)在有不少學(xué)者提出DHA對動物機體有較大的毒副作用，人體長期服用會引起腎結(jié)石、肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，還可能會引起體重的減少和慢性肺水腫。目前，DHA已被列入QS認(rèn)證必檢項目。有些學(xué)者認(rèn)為其不宜作為食品防腐劑［1］。DHA作為食品添加劑的安全性倍受爭議，但目前國內(nèi)外關(guān)于DHA安全性的研究卻很少見。

圖1 DHA的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

小鼠骨髓微核試驗是ICH推薦的致突變標(biāo)準(zhǔn)試驗，以小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞中微核為評價指標(biāo)，具有經(jīng)濟、快速、準(zhǔn)確的特點［2～4］。微核的形成是細(xì)胞受遺傳毒物作用后的一種遺傳學(xué)終點，以觀察細(xì)胞中微核的形成來檢測遺傳毒物，稱為微核試驗。微核試驗是以動植物為材料，利用細(xì)胞生物學(xué)方法觀察其出現(xiàn)的微核率(micronucleus rate)來表示材料受遺傳損傷程度的一種檢測遺傳毒性的方法［5］。

本試驗通過檢測小鼠骨髓細(xì)胞中嗜多染紅細(xì)胞(PCE)中的微核出現(xiàn)率來判斷DHA是否具有致突變作用，為DHA作為廣譜食品添加劑的安全性評價提供基本數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 藥品及試劑 脫氫乙酸(DHA)標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.9%，力德士化工北京業(yè)務(wù)部，批號:20080320);羧甲基纖維素鈉(CMC－Na);小牛血清，(產(chǎn)地:新西蘭，品牌:Hyclone)。

1.2 儀器及器械 1 mL無菌注射器、灌胃針、Giemsa、手術(shù)剪、晾片架、載玻片及推片、定時鐘、帶油鏡的顯微鏡、細(xì)胞計數(shù)器、培養(yǎng)箱、壓力蒸汽消毒器、低溫冰箱(－80℃)或液氮生物容器、天平(精密度0.1 g 和0.000 1 g)、菌落計數(shù)器、玻璃器皿等。

1.3 緩沖液及染色液 甲液:1/15 mol·L－1磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液，稱取 Na2HPO4·12H2O 23.88 g，溶于1 000 mL蒸餾水。

乙液:1/15 mol·L－1磷酸二氫鉀(KH2PO4)溶液，稱取KH2PO49.08 g溶于1 000 mL蒸餾水。

pH 6.47磷酸鹽緩沖液:取甲液30 mL和乙液70 mL混合即可。

Giemsa染液:取1.5 g Giemsa原粉，加50 mL 甘油，置于60℃溫箱，約3 h后溶解。取出后加入50 mL甲醇，即為母液。使用前將母液與pH 6.47磷酸鹽緩沖液按1∶10的比例混合即成工作液。

1.4 實驗動物 ICR小鼠50只，SPF級，體重18～20 g，雌雄各半，購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心(動物合格證號:2121606)。

2 方法

2.1 染毒 按照1/10 LD50、1/5 LD50和1/2 LD50設(shè)置三個劑量組(LD50為 1 313.29 mg·kg－1)，三個劑量組分別用130、260、660 mg·kg－1。三個劑量組分別配置 DHA 濃度為:1.3、2.6、6.6 mg·mL－1，按照1 mL·(10 g)－1體重給藥。另設(shè)置正常對照組和環(huán)磷酰胺(CP)陽性對照組(100 mg·kg－1)。

每組10只小鼠，雌雄各半，灌胃給藥，兩次攻毒時間間隔24 h。在第二次灌胃后6 h，脫頸椎處死小鼠。

2.2 制片染色 取小鼠兩側(cè)股骨，剔去肌肉，用濾紙或紗布擦去血污和肌肉，剪去股骨兩端。用配有6號針頭的1 mL注射器吸取小牛血清0.05 mL，從股骨上端開口處沖洗骨髓腔數(shù)次，將沖洗物從股骨下端開口處滴在載玻片上。將載玻片上的沖洗物調(diào)勻后，推片。迅速干燥，可在酒精燈上短時烘烤。

將干燥的涂片置于甲醇中固定5～10 min，取出晾干。用1∶10的吉姆薩－磷酸鹽緩沖液(pH 6.47)染色20 min。用蒸餾水沖洗，干燥，待檢。

2.3 鏡檢及PCE微核細(xì)胞計數(shù) 油鏡下，PCE呈灰藍(lán)色，成熟的正染紅細(xì)胞(NCE)呈粉紅色。計數(shù)每只小鼠1 000個PCE中的微核細(xì)胞數(shù)，計算微核率。公式為:PCE微核率=有微核的PCE總數(shù)/檢查PCE數(shù)×100%，微核率以‰表示。另外計數(shù)200個紅細(xì)胞中的PCE和NCE數(shù)，求出PCE/NCE的值。

2.4 微核試驗結(jié)果判定 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，統(tǒng)計學(xué)比較采用單因素方差分析。

若微核率統(tǒng)計結(jié)果差異顯著(P＜0.05)，并有劑量反應(yīng)關(guān)系時判為陽性，反之則為陰性。

PCE/NCE的比值應(yīng)在0.6～1.2的范圍內(nèi)。若比值小于0.1，則表示PCE形成受到嚴(yán)重抑制;若比值小于0.05，則表示受試物劑量過大，試驗結(jié)果不可靠。

3 結(jié)果

各試驗組PCE/NCE值在正常范圍內(nèi)，所以結(jié)果是可靠的。表中各組經(jīng)方差分析得出:與正常對照組微核率相比，130 mg·kg－1和 260 mg·kg－1劑量差異不顯著，660 mg·kg－1劑量組有顯著差異(P＜0.05)，本次試驗沒有劑量依賴性關(guān)系;陽性對照組微核率與正常對照組及各劑量組相比均有顯著差異(P＜0.05)。DHA微核試驗結(jié)果判為陰性。微核率和PCE/NCE統(tǒng)計見表1。

表1 微核率(±s)和PCE/NCE統(tǒng)計

表1 微核率(±s)和PCE/NCE統(tǒng)計

注:與正常對照組比較，*P＜0.05;與陽性對照組比較，#P＜0.05

1.05 ±0.08 130 mg·kg－1 10 3.01 ±1.24# 1.07 ±0.10 260 mg·kg－1 10 2.69 ±1.39# 1.09 ±0.11 660 mg·kg－1 10 5.17 ±1.67*# 1.11 ±0.08陽性對照組 10 32.9 ±6.46*PCE/NCE正常對照組 10 1.79 ±1.19#劑量組 動物數(shù) 微核率(‰)0.99 ±0.15

4 討論

試驗結(jié)果顯示:660 mg·kg－1劑量組微核率與正常對照組有顯著差異(P＜0.05)，其他劑量組未引起顯著差異，且沒有明顯的劑量依賴性關(guān)系，故判定脫氫乙酸小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗為陰性。筆者認(rèn)為盡管本次實驗結(jié)果判定為陰性，但脫氫乙酸作為被廣泛應(yīng)用的食品添加劑，其安全性與人民群眾的健康息息相關(guān)，因此有必要進(jìn)一步對其安全性做更全面的評價。

［1］駱萌.脫氫醋酸及其相關(guān)化合物生產(chǎn)技術(shù)［J］.化工中間體，2004，1(7):33 －34.

［2］傅鵬，張宗鵬.新藥評價中遺傳毒性試驗方法學(xué)研究及其發(fā)展趨勢［J］.天津藥學(xué)，2004，16(5):43－46.

［3］黃芳華.ICH遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)試驗組合的最新要求［J］.藥物評價研究，2009，32(1):10 －12.

［4］黃芳華.ICH遺傳毒性結(jié)果評價和追加試驗策略指導(dǎo)原則介紹［J］.藥物評價研究，2009，32(2):81 －83.

［5］李宏.微核試驗的研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(7):2864－2866.