人心房利鈉肽對(duì)機(jī)械通氣肺損傷大鼠肺組織NF－κBp65的表達(dá)及影響＊

季艷梅，鄭 翔，張浩明，方志成，郭家龍

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 十堰 442000）

機(jī)械通氣是救治急性肺損傷或者呼吸衰竭等危重癥的有效措施之一。但隨著機(jī)械通氣的應(yīng)用，我們發(fā)現(xiàn)它本身可誘發(fā)或加重肺損傷，即機(jī)械通氣所致肺損傷（VILI）。人心房利鈉肽（ANP）一種活性多肽，具有利鈉、利尿、擴(kuò)張血管、調(diào)節(jié)體液平衡、抑制炎性介質(zhì)釋放等多種作用［1］。本研究擬觀察機(jī)械通氣損傷大鼠肺組織NF－κB，肺水含量及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的改變，探討ANP對(duì)VILI的治療作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑 人心房利鈉肽（批號(hào)：S21535－312，Sigma公司，德國(guó)）；大鼠TNF－α及IL－1βELISA檢測(cè)試劑盒（ADL公司，美國(guó)）；NF－κB P65多克隆抗體（Santa cruze公司，美國(guó)）。

1.2 動(dòng)物分組與模型制備 湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供Wistar大鼠30只 ，隨機(jī)分為3組，對(duì)照組（TV組，潮氣量8ml／kg）、機(jī)械通氣肺損傷組（HV組，潮氣量40ml／kg）和hANP預(yù)處理組，于機(jī)械通氣30min后靜脈注射hANP（0.1g／kg·min）。由左股靜脈置管輸液，給藥，間斷靜脈注射順式阿曲庫(kù)銨維持肌松。氣管切開后插入氣管導(dǎo)管，接HX－300小動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣，呼吸頻率40bpm，吸呼比1∶1，吸入氣體為空氣。TV組和HV組于相同時(shí)點(diǎn)靜脈注射等體積生理鹽水。

1.3 標(biāo)本采集及檢測(cè)方法 機(jī)械通氣4小時(shí)時(shí)靜脈注射氯化鉀處死大鼠。

1.3.1 肺組織核蛋白提取及定量 取右下肺葉肺組織約100mg，，充分洗滌，加入裂解緩沖液A，冰上放置15～30min，，電動(dòng)勻漿后加入500μl 10%Nonidet P－40，渦旋，離心30s，上清為細(xì)胞漿蛋白。取沉淀物洗滌，離心30s，棄上清。加入核蛋白提取裂解液B，冰上放置30min，然后離心，吸出上清（核蛋白），Bradford比色法測(cè)定核蛋白濃度，并調(diào)至0.5～1.0μg／μl，置于－70℃保存。

1.3.2 免疫蛋白印跡法（western blot）測(cè)定 NF－κB P65的表達(dá) 用組織蛋白提取試劑盒，在冰上操作，收集細(xì)胞離心、棄培養(yǎng)液、洗滌細(xì)胞，按1×109／L加入細(xì)胞蛋白裂解液，BCA試劑盒蛋白定量。各組標(biāo)本加入蛋白上樣緩沖液后95℃加熱5分鐘，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉室溫封閉1小時(shí)后加入抗NF－Κb P65I抗，孵育過夜，洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H＋L，1∶5000稀釋），常溫孵育1小時(shí)；ECL發(fā)光顯色，暗室曝光，顯影，洗片。用HPIAS2000型圖像分析軟件（北京航天航空大學(xué)）進(jìn)行圖像分析，以平均灰度值表示NF－κB P65的表達(dá)水平。

1.3.3 細(xì)胞因子的測(cè)定 肺組織置于4℃緩沖液中，制成勻漿，離心取上清，用大鼠ELISA試劑盒分別測(cè)定 TNF－a和IL－lβ含量。

1.3.4 肺組織濕／干重比（W／D） 將左肺下葉組織用濾紙吸干水分，在分析天平上精確稱濕重（W）后放入80℃烤箱，烘烤48小時(shí)后稱干重（D），計(jì)算肺組織濕／干重比（W／D）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 機(jī)械通氣肺損傷模型的復(fù)制 大鼠高氣道壓機(jī)械通氣后，心率增快，血氧飽和度下降，嚴(yán)重者在實(shí)驗(yàn)中途死亡。病理學(xué)檢查肺損傷明顯，有明顯的炎癥細(xì)胞聚集，部分肺泡腔出血、廣泛滲出，見圖1。

圖1 肺損傷模型Figure 1 Model of pulmonary injury

2.2 3組肺組織 NF－κB P65表達(dá)及 TNF－a、IL－lβ水平比較 與TV組相比，HV、HV＋hANP組肺組織NF－κB P65表達(dá)明顯增加，HV、HV＋hANP組肺組織 TNF－a、IL－lβ含量明顯上升（P＜0.05），肺組織 W／D升高（P＜0.05）；與HV組相比，HV＋hANP組肺組織 NF－κB P65表達(dá)明顯抑制，肺組織 TNF－a、IL－lβ含量明顯降低（P＜0.05），肺組織 W／D明顯降低（P＜0.05），見表1。各組大鼠肺組織NF－κB P65免疫印跡法結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織NF－κB P65免疫印跡法結(jié)果Figure 2 Immuneblot of NF－κB P65in lung tissue in each group

表1 3組肺組織NF－κB P65表達(dá)、W／D及TNF－a、IL－lβ水平比較（，n＝10）Table 1 Comparison of NF－κB P65，W／D and TNF－a，IL－lβin lung tissue in the four groups

表1 3組肺組織NF－κB P65表達(dá)、W／D及TNF－a、IL－lβ水平比較（，n＝10）Table 1 Comparison of NF－κB P65，W／D and TNF－a，IL－lβin lung tissue in the four groups

注：與TV組比較，①P＜0.05；與 HV組比較，②P＜0.05

組別 肺組織 W／D NF－κB P65 TNF－a（pg／ml） IL－lβ（pg／ml）TV組4.1±0.5 139±10 124.26±10.18 126.62±10.73 HV組 9.7±1.2① 238±24① 519.22±35.31① 751.82±65.35①HV＋hANP組 6.4±0.9①② 178±14①② 283.54±24.16①② 316.29±25.65①②

3 討論

從本質(zhì)上說，氣壓傷實(shí)際上是容積傷。本研究通過高氣道壓通氣成功復(fù)制 VILI模型，結(jié)果表明，與TV組相比，HV 組肺組織 TNF－a、IL－lβ含量上升，W／D比值升高，病理學(xué)檢查肺損傷明顯，有明顯的炎癥細(xì)胞聚集，部分肺泡腔出血、廣泛滲出，表明肺通透性增加，病理損傷加重，提示大鼠機(jī)械通氣肺損傷模型制備成功。

VILI的臨床表現(xiàn)多樣，主要包括氣壓傷、肺水腫等，其發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜［2］。本研究中HV組肺組織W／D比值升高，病理學(xué)檢查肺間質(zhì)水腫明顯，表明肺水含量明顯增加，提示肺水腫是導(dǎo)致機(jī)械通氣肺損傷的主要因素。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)HV組TNF－a、IL－lβ含量上升，病理學(xué)檢查炎癥細(xì)胞聚集，表明促炎因子過度激活，細(xì)胞因子失衡，是VILI發(fā)生、發(fā)展的重要因素。分析其原因，可能為機(jī)械通氣吸氣相引起肺泡擴(kuò)張，導(dǎo)致較大的牽拉肺泡毛細(xì)血管的縱向張力，使毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞損傷，通透性增加，富含蛋白的血漿成分漏出，導(dǎo)致肺水腫。血漿成分的漏出可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而從上游水平激發(fā)炎癥“瀑布”，TNF－α等前炎癥因子與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，從而引起炎性反應(yīng)放大和粘附分子的增加［4］。NF－κB P65是誘導(dǎo)許多基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子。本研究 NF－κB P65表達(dá)的增加，說明它被 TNF－a、IL－lβ等炎性細(xì)胞因子激活，而與p38MAPK共同組成釋放炎癥因子的關(guān)鍵信號(hào)通路，反之又可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子表達(dá)，從而廣泛參與炎癥介質(zhì)和前炎癥介質(zhì)、黏附分子、趨化因子和一些炎性相關(guān)酶等基因的調(diào)控，在VILI的疾病演進(jìn)過程中起到一定的作用［5］。研究抑制NF－κB P65產(chǎn)生及生物活性的藥物，可能是治療機(jī)械通氣肺損傷的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

人心房利鈉肽（ANP）是一種活性多肽，具有利鈉、利尿、擴(kuò)張血管、調(diào)節(jié)體液平衡、抑制炎性介質(zhì)釋放等多種作用。本研究HV＋hANP組肺組織W／D降低，說明使用hANP預(yù)處理后肺水含量明顯降低，與人心房利尿鈉肽的利鈉、利尿、調(diào)節(jié)體液平衡，擴(kuò)張血管的作用密不可分［4］。同時(shí)肺組織 NF－κB P65表達(dá)降低，肺組織TNF－a、IL－lβ含量降低，提示靜脈使用ANP可抑制NF－κB的表達(dá)進(jìn)而減輕機(jī)械通氣大鼠肺部的炎癥反應(yīng)。分析其原因，可能為人心房利鈉肽（ANP）通過抑制炎性介質(zhì)釋放等多種作用使得使得細(xì)胞內(nèi)氧化 －還原狀態(tài)發(fā)生改變，超過了細(xì)胞的自身調(diào)節(jié)能力，氧化還原狀態(tài)失衡，進(jìn)而抑制NF－κB的活性 ，最終抑制了包括TNF－a、IL－lβ等在內(nèi)的炎癥介質(zhì)的釋放［5］。由此可見，在炎癥反應(yīng)中NF－κB的活化對(duì)于調(diào)節(jié)促炎、抑炎平衡起關(guān)鍵作用，維持NF－κB的正?；钚詫?duì)于減少炎癥失衡所致的結(jié)構(gòu)細(xì)胞損傷有重要意義。因此，ANP的抗炎、保護(hù)臟器的作用可能是通過降低細(xì)胞內(nèi)GSSG水平進(jìn)而抑制NF－κB的活性而實(shí)現(xiàn)的。

4 結(jié)論

ANP在機(jī)械通氣誘導(dǎo)的大鼠ALI中具有重要的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是抑制NF－κB的激活來緩解炎癥反應(yīng)，使細(xì)胞因子、黏附因子、趨化因子、生物活性酶等炎癥介質(zhì)表達(dá)減少，從而達(dá)到治療的效果。

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