同位素稀釋—激光剝蝕—電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定生物組織樣品中鐵元素的含量

馮流星　王軍

摘要：針對(duì)目前采用同位素稀釋激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜（IDLAICPMS）對(duì)固體生物組織切片樣品難以實(shí)現(xiàn)原位準(zhǔn)確定量的難題，本研究將同位素稀釋法與LAICPMS技術(shù)相結(jié)合，通過開展生物組織樣品與濃縮稀釋劑的同位素充分交換平衡、稀釋劑添加方式、原位的同位素比測(cè)量等關(guān)鍵技術(shù)研究，確定了組織切片與同位素稀釋劑的最佳平衡時(shí)間、稀釋劑的質(zhì)量以及選用甲醇作為稀釋劑溶劑等實(shí)驗(yàn)條件，建立了基于同位素稀釋技術(shù)的LAICPMS技術(shù)在生物樣品組織切片中Fe元素的微區(qū)定量分析方法，并采用實(shí)驗(yàn)室自行制備的均勻的山羊腦和牛肝組織切片標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證，通過IDLAICPMS方法的測(cè)量結(jié)果與微波消解同位素稀釋方法的測(cè)量結(jié)果相一致，驗(yàn)證了該方法的有效性和可靠性。本方法可進(jìn)一步應(yīng)用于臨床中生物組織切片樣品中金屬元素的原位、微區(qū)定量測(cè)量及成像分析。

關(guān)鍵詞：同位素稀釋； 激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜； 原位微區(qū)定量； 組織切片

1引言

激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜（LAICPMS）是在質(zhì)譜檢測(cè)的基礎(chǔ)上結(jié)合激光剝蝕進(jìn)樣技術(shù)而成的一種固體微區(qū)分析新技術(shù)[1]。該技術(shù)固體進(jìn)樣前處理相對(duì)簡單，引入等離子體的干氣溶膠較濕法進(jìn)樣干擾少，且其原位（insitu）、微區(qū)、快速的分析優(yōu)勢(shì)，以及靈敏度高、檢出限低、空間分辨率小于10 μm、可進(jìn)行多種元素含量和同位素組成測(cè)量的能力成為已成為生物醫(yī)學(xué)研究中一種很有潛力的分析方法，近年來已成為質(zhì)譜分析技術(shù)應(yīng)用的前沿。在生物臨床領(lǐng)域中的應(yīng)用報(bào)道中，研究對(duì)象涉及植物[2～4]、動(dòng)物腦[5～8]和其它生物組織切片[9～13]樣品等。然而，LAICPMS技術(shù)在生物臨床領(lǐng)域的應(yīng)用中，由于目前與待測(cè)樣品基體相匹配的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)樣品還相當(dāng)匱乏，而該技術(shù)本身受樣品基體效應(yīng)、分餾效應(yīng)、質(zhì)量歧視等是影響又十分嚴(yán)重，導(dǎo)致LAICPMS在準(zhǔn)確定量分析方面存在較大困難[14]。目前，LAICPMS應(yīng)用研究多集中于元素含量的相對(duì)測(cè)量，即用相對(duì)計(jì)數(shù)表示含量，不能給出絕對(duì)量值，難以滿足生物醫(yī)學(xué)研究中對(duì)生物組織樣品原位、微區(qū)元素分布準(zhǔn)確定量分析的要求。

同位素稀釋質(zhì)譜法（IDMS）是國際公認(rèn)的高準(zhǔn)確度分析方法之一，如能將靈敏、準(zhǔn)確的同位素稀釋技術(shù)與可以實(shí)現(xiàn)原位、微區(qū)分析的LAICPMS結(jié)合，將為解決LAICPMS進(jìn)行生物樣品原位微區(qū)準(zhǔn)確定量元素測(cè)量提供一條理想途徑。目前，基于IDMS技術(shù)LAICPMS定量方法研究，主要包括兩種方案：（1）固體稀釋劑標(biāo)記技術(shù)（Solidspiking for direct analysis）。通過采用溶液稀釋劑與固體樣品混合、均勻化、干燥等步驟，使稀釋劑與固體樣品中待測(cè)元素發(fā)生同位素交換，制備出可用于標(biāo)記待測(cè)固體樣品的固體稀釋劑，該固體稀釋劑可以與待測(cè)樣品混合、均勻、壓片后，用于LAICPMS測(cè)量的樣品[15～17]。該方法由于采用了IDMS技術(shù)，使得LAICPMS定量分析準(zhǔn)確度有所提高，減小了測(cè)量不確定度，然而卻不能應(yīng)用于組織切片的原位、微區(qū)分析。（2）溶液稀釋劑在線引入技術(shù)[18～20]。即通過溶液稀釋劑在線引入到激光剝蝕樣品池，在池中與剝蝕固體樣品產(chǎn)生的氣溶膠混合并發(fā)生同位素交換，混合氣溶膠引入到ICPMS中進(jìn)行測(cè)量。這種方式制樣過程相對(duì)簡單，適用性較強(qiáng)，沒有樣品與稀釋劑混合、均勻化的過程，因此可應(yīng)用于組織切片樣品的原位、微區(qū)定量分析。然而，此方法在應(yīng)用中還存在兩個(gè)技術(shù)難點(diǎn)：一是如何確定與待測(cè)樣品發(fā)生反應(yīng)的稀釋劑質(zhì)量；二是如何確定稀釋劑與樣品之間的同位素交換是否達(dá)到平衡。目前，將IDMS方法與LAICPMS相結(jié)合，用于組織切片樣品的原位、微區(qū)絕對(duì)定量分析尚未見報(bào)道。

本研究基于同位素稀釋法與LAICPMS相結(jié)合的技術(shù)，開展了生物組織樣品與濃縮稀釋劑的同位素充分交換平衡、稀釋劑添加方式、原位的同位素比測(cè)量等關(guān)鍵技術(shù)的探索性研究，建立了同位素稀釋LAICPMS技術(shù)在生物樣品組織切片中Fe元素原位定量分析方法，并采用自行制備的均勻的山羊腦和牛肝組織切片標(biāo)準(zhǔn)樣品驗(yàn)證了方法的有效性和可靠性。在下一步的研究中，本方法將應(yīng)用到小鼠腦組織切片中鐵元素的二維原位微區(qū)掃描中，給出小鼠腦組織中鐵元素的原位、微區(qū)定量測(cè)量及成像分布結(jié)果，這將對(duì)于腦中鐵元素的分布變化與老年癡呆病的聯(lián)系研究具有重要的臨床意義。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

UP213 Nd：YAG激光剝蝕系統(tǒng)（美國New Wave公司），高分辨電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ELEMENT 2，美國Thermo公司），全自動(dòng)冷凍切片機(jī)（德國SLEE公司），免疫組化筆（Liquid blocker pen，美國Sigma公司）。

本實(shí)驗(yàn)中所用的山羊腦組織樣品由英國LGC提供；用于切片的牛肝樣品為SRM1577c （NIST，美國）；明膠試劑（美國Sigma公司）；57FeO濃縮同位素稀釋劑（99.99%，國際原子能機(jī)構(gòu)（IAEA）），該稀釋劑樣品經(jīng)消解、稀釋、定容后配制成0.3053 μg/g，用MCICPMS測(cè)定56Fe/57Fe為0.03154。10 ng/g的Li， Y， Tl調(diào)諧液及玻璃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM610 （NIST，美國）用于優(yōu)化LA及HRICPMS的儀器條件。

2.2樣品前處理

4結(jié)論

針對(duì)目前采用的IDLAICPMS對(duì)固體生物組織樣品難以實(shí)現(xiàn)原位準(zhǔn)確定量的難題，本研究將同位素稀釋法與LAICPMS技術(shù)結(jié)合，開展了生物組織樣品與濃縮稀釋劑的同位素充分交換平衡、稀釋劑添加方式、原位的同位素比測(cè)量等關(guān)鍵技術(shù)的探索研究，通過對(duì)山羊腦組織和牛肝組織樣品切片的原位定量分析的應(yīng)用與比較，證明了本方法對(duì)實(shí)現(xiàn)生物組織樣品原位準(zhǔn)確定量分析具有可行性。在下一步的工作中，將進(jìn)一步將該方法應(yīng)用到小鼠腦組織切片中，開展腦組織中Fe元素的原位、微區(qū)定量分析，并開展同位素稀釋劑的形態(tài)差異對(duì)生物組織中元素微區(qū)原位定量結(jié)果的影響研究。

References

1SUN XiaoHong， HU MingYue， LIU ChengLin， JIAO PengCheng， MA LiChun， WANG Xin， ZHAN XiuChun. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（2）： 235-241

2So P W， Kalber T， Hunt D， Farquharson M. Farquharson M， AlEbraheem A， Parkes H G， Simon R， Bell J D. Cell Transplantation， 2010， 19（2）： 419-429

3Becker J S， Dietrich R C， Matusch A， Pozebon D， Dressler V L. Spectrochim. Acta Part B， 2008， 63（11）： 1248-1252

4Wu B， Zoriyb M， Chena Y X， Becker J S. Talanta， 2009， 78（1）： 132-137

5Hoffmann E， Ludke C， Skole J， Stephanowitz H， Ullrich E， Colditz D. Fresenius J. Anal. Chem.， 2000， 367（6）： 579-585

6Dobrowolska J， Dehnhardt M， Matusch A， Zoriy M， PalomeroGallagher N， Koscielniak P， Zilles K， Becker J S. Talanta， 2008， 74（4）： 717-723

7Jackson B， Harper S， Smith L， Flinn J. Anal. Bioanal. Chem.， 2006， 384（4）： 951-957

8Zoriy M V， Dehnhardt M， Matusch A， Becker S. Spectroc Acta Part B， 2008， 63（3）： 375-382

9Hare D， Reedy B， Grimm R， Wilkins S， Volitakis I， George J L， Cherny R A， Bush A I， Finkelstein D I，Doble P. Metallomics， 2009， 1（1）： 53-58

10Corbin B D， Seeley E H， Raab A， Feldmann J， Miller M R， Torres V J， Anderson K L， Dattilo B M， Dunman P M， Gerads R， Caprioli R M， Nacken W， Chazin W， Skaar E P. Science， 2008， 319（15）： 962-965

11Kindness A， Sekaran C. Feldmann. J. Clin. Chem.， 2003， 49（11）： 1916-1923

12Feldmann J， Kindness A， Ek P. J. Anal. At. Spectrom.， 2002， 17（8）： 813-818

13Becker J S， Matusch A， Depboylu C， Dobrowolska J， Zoriy M V. Anal. Chem， 2007， 79（16）： 6074-6080

14Dominic H， ChristineA， Philip D. Analyst， 2012， 137（7）： 1527-1537

15FernndezClaverie F， Pecheyran C， Alexis J， Donard O F X. J. Anal. At. Spectrom.， 2008， 23（3）： 367-377

16Konz I， Fernandez B， Fernandez M L， Pereiro R， SanzMedel A. Anal. Chem， 2011， 83（13）： 5353-5360

17Fernndez Claverie F， Pecheyran C， Alexis J， Donard O F X. Anal. Chem.， 2008， 80（18）： 6981-6994

18Yanga K， Chi P H， Lin Y C， Sun Y C， Yang M H. Talanta， 2010， 80（3）： 1222-1227

19PickhardtIzmer A V， Zoriy M V， Schaumloffel D， Becker J S. Int. J. Mass Spectrom.， 2006， 248（3）： 136-141

20Becker J S， Pickhardt C， Pompe W. Int. J. Mass Spectrom.， 2004， 237（1）： 13-17

21Feng L， Wang J， Chao J， Hai L. J. Anal. At. Spectrom.， 2009， 24（12）： 1676-1680

References

1SUN XiaoHong， HU MingYue， LIU ChengLin， JIAO PengCheng， MA LiChun， WANG Xin， ZHAN XiuChun. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（2）： 235-241

2So P W， Kalber T， Hunt D， Farquharson M. Farquharson M， AlEbraheem A， Parkes H G， Simon R， Bell J D. Cell Transplantation， 2010， 19（2）： 419-429

3Becker J S， Dietrich R C， Matusch A， Pozebon D， Dressler V L. Spectrochim. Acta Part B， 2008， 63（11）： 1248-1252

4Wu B， Zoriyb M， Chena Y X， Becker J S. Talanta， 2009， 78（1）： 132-137

5Hoffmann E， Ludke C， Skole J， Stephanowitz H， Ullrich E， Colditz D. Fresenius J. Anal. Chem.， 2000， 367（6）： 579-585

6Dobrowolska J， Dehnhardt M， Matusch A， Zoriy M， PalomeroGallagher N， Koscielniak P， Zilles K， Becker J S. Talanta， 2008， 74（4）： 717-723

7Jackson B， Harper S， Smith L， Flinn J. Anal. Bioanal. Chem.， 2006， 384（4）： 951-957

8Zoriy M V， Dehnhardt M， Matusch A， Becker S. Spectroc Acta Part B， 2008， 63（3）： 375-382

9Hare D， Reedy B， Grimm R， Wilkins S， Volitakis I， George J L， Cherny R A， Bush A I， Finkelstein D I，Doble P. Metallomics， 2009， 1（1）： 53-58

10Corbin B D， Seeley E H， Raab A， Feldmann J， Miller M R， Torres V J， Anderson K L， Dattilo B M， Dunman P M， Gerads R， Caprioli R M， Nacken W， Chazin W， Skaar E P. Science， 2008， 319（15）： 962-965

11Kindness A， Sekaran C. Feldmann. J. Clin. Chem.， 2003， 49（11）： 1916-1923

12Feldmann J， Kindness A， Ek P. J. Anal. At. Spectrom.， 2002， 17（8）： 813-818

13Becker J S， Matusch A， Depboylu C， Dobrowolska J， Zoriy M V. Anal. Chem， 2007， 79（16）： 6074-6080

14Dominic H， ChristineA， Philip D. Analyst， 2012， 137（7）： 1527-1537

15FernndezClaverie F， Pecheyran C， Alexis J， Donard O F X. J. Anal. At. Spectrom.， 2008， 23（3）： 367-377

16Konz I， Fernandez B， Fernandez M L， Pereiro R， SanzMedel A. Anal. Chem， 2011， 83（13）： 5353-5360

17Fernndez Claverie F， Pecheyran C， Alexis J， Donard O F X. Anal. Chem.， 2008， 80（18）： 6981-6994

18Yanga K， Chi P H， Lin Y C， Sun Y C， Yang M H. Talanta， 2010， 80（3）： 1222-1227

19PickhardtIzmer A V， Zoriy M V， Schaumloffel D， Becker J S. Int. J. Mass Spectrom.， 2006， 248（3）： 136-141

20Becker J S， Pickhardt C， Pompe W. Int. J. Mass Spectrom.， 2004， 237（1）： 13-17

21Feng L， Wang J， Chao J， Hai L. J. Anal. At. Spectrom.， 2009， 24（12）： 1676-1680

References

1SUN XiaoHong， HU MingYue， LIU ChengLin， JIAO PengCheng， MA LiChun， WANG Xin， ZHAN XiuChun. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（2）： 235-241

2So P W， Kalber T， Hunt D， Farquharson M. Farquharson M， AlEbraheem A， Parkes H G， Simon R， Bell J D. Cell Transplantation， 2010， 19（2）： 419-429

3Becker J S， Dietrich R C， Matusch A， Pozebon D， Dressler V L. Spectrochim. Acta Part B， 2008， 63（11）： 1248-1252

4Wu B， Zoriyb M， Chena Y X， Becker J S. Talanta， 2009， 78（1）： 132-137

5Hoffmann E， Ludke C， Skole J， Stephanowitz H， Ullrich E， Colditz D. Fresenius J. Anal. Chem.， 2000， 367（6）： 579-585

6Dobrowolska J， Dehnhardt M， Matusch A， Zoriy M， PalomeroGallagher N， Koscielniak P， Zilles K， Becker J S. Talanta， 2008， 74（4）： 717-723

7Jackson B， Harper S， Smith L， Flinn J. Anal. Bioanal. Chem.， 2006， 384（4）： 951-957

8Zoriy M V， Dehnhardt M， Matusch A， Becker S. Spectroc Acta Part B， 2008， 63（3）： 375-382

9Hare D， Reedy B， Grimm R， Wilkins S， Volitakis I， George J L， Cherny R A， Bush A I， Finkelstein D I，Doble P. Metallomics， 2009， 1（1）： 53-58

10Corbin B D， Seeley E H， Raab A， Feldmann J， Miller M R， Torres V J， Anderson K L， Dattilo B M， Dunman P M， Gerads R， Caprioli R M， Nacken W， Chazin W， Skaar E P. Science， 2008， 319（15）： 962-965

11Kindness A， Sekaran C. Feldmann. J. Clin. Chem.， 2003， 49（11）： 1916-1923

12Feldmann J， Kindness A， Ek P. J. Anal. At. Spectrom.， 2002， 17（8）： 813-818

13Becker J S， Matusch A， Depboylu C， Dobrowolska J， Zoriy M V. Anal. Chem， 2007， 79（16）： 6074-6080

14Dominic H， ChristineA， Philip D. Analyst， 2012， 137（7）： 1527-1537

15FernndezClaverie F， Pecheyran C， Alexis J， Donard O F X. J. Anal. At. Spectrom.， 2008， 23（3）： 367-377

16Konz I， Fernandez B， Fernandez M L， Pereiro R， SanzMedel A. Anal. Chem， 2011， 83（13）： 5353-5360

17Fernndez Claverie F， Pecheyran C， Alexis J， Donard O F X. Anal. Chem.， 2008， 80（18）： 6981-6994

18Yanga K， Chi P H， Lin Y C， Sun Y C， Yang M H. Talanta， 2010， 80（3）： 1222-1227

19PickhardtIzmer A V， Zoriy M V， Schaumloffel D， Becker J S. Int. J. Mass Spectrom.， 2006， 248（3）： 136-141

20Becker J S， Pickhardt C， Pompe W. Int. J. Mass Spectrom.， 2004， 237（1）： 13-17

21Feng L， Wang J， Chao J， Hai L. J. Anal. At. Spectrom.， 2009， 24（12）： 1676-1680