有機氯農(nóng)藥與腫瘤相關基因DNA間的作用機制研究

魯嘉等

摘要：利用紫外可見（UVvis）吸收光譜、熒光（FL）光譜和圓二色譜（CD）研究了3種有機氯農(nóng)藥＼[DDT， DDE和DDD＼]與人類腫瘤相關基因（p53 DNA和Cmyc DNA）的相互作用，闡明有機氯農(nóng)藥的基因毒性。UVvis和FL光譜實驗表明， 有機氯農(nóng)藥主要通過嵌插方式與DNA堿基作用，形成非共價復合物。通過FL實驗得到的農(nóng)藥分子與p53 DNA的結合能力順序為：DDE>DDT>DDD，對Cmyc DNA為：DDD>DDE>DDT；并通過計算結合過程的熱力學常數(shù)證實以疏水作用為主要的作用力。CD實驗表明， 部分有機氯農(nóng)藥能夠影響DNA的堿基對堆積和二級結構，很可能進一步造成DNA損傷，并最終導致基因突變。

關鍵詞：有機氯農(nóng)藥； 脫氧核糖核酸； 相互作用； 光譜法； 嵌插作用

1引言

有機氯農(nóng)藥主要以苯或環(huán)戊二烯兩大類為原料，曾作為殺蟲劑被廣泛使用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，其化學性質穩(wěn)定和難以分解的特性造成了環(huán)境的嚴重污染。接觸有機氯農(nóng)藥后，罹患白血病、乳腺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）腫瘤以及Wilm′s腫瘤的風險增大[1，2]。已有研究表明， 有機氯農(nóng)藥能對人體血紅細胞和淋巴細胞中DNA造成損傷，具有誘導基因癌變的可能性[3，4]。80%腫瘤疾病受到環(huán)境因素的影響[5，6]。因此有必要在分子水平上探討環(huán)境中有機小分子與人類腫瘤相關DNA間的作用機制。小分子物質與DNA之間的非共價結合方式主要有嵌插結合、溝區(qū)結合和靜電結合，其中當小分子嵌插到DNA堿基對之間后，可以直接抑制DNA的復制與轉錄，甚至使DNA鏈斷裂受損。此外，有機小分子可能會與DNA形成加合物而引起DNA的損傷，有可能產(chǎn)生誘變作用而最終引發(fā)癌變[7，8]。 p53基因是一種抑癌基因，人類癌癥中約有一半是由于該基因發(fā)生突變失活，是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關性最高的基因[9～12]。Cmyc基因是一種可使細胞獲永生化功能，促進細胞分裂的基因[13，14]。研究發(fā)現(xiàn)， 多種腫瘤疾病中都發(fā)現(xiàn)有Cmyc基因的擴增或過度表達[15，16]。

本研究選擇3種有機氯農(nóng)藥DDT及其在環(huán)境中脫氧化氫產(chǎn)物DDE和還原產(chǎn)物DDD（圖1）為研究對象，利用一些譜學方法系統(tǒng)研究這些農(nóng)藥與人體腫瘤相關基因（p53抑癌基因和Cmyc癌基因）啟動子區(qū)雙螺旋DNA間的相互作用，希望能為農(nóng)藥生物毒性的解析、腫瘤疾病的預防和治療提供線索。

3結果與討論

3.1紫外滴定實驗研究有機氯農(nóng)藥分子與DNA的作用模式

研究證明，有機小分子與DNA的相互作用會引起小分子的特征吸收帶出現(xiàn)紅移（藍移）現(xiàn)象或增色（減色）效應。尤其是以嵌插方式與DNA堿基對發(fā)生作用時，小分子的光譜變化會更明顯。隨著DNA的加入，有機氯農(nóng)藥分子溶液的UVvis吸收光譜變化明顯。由圖2A可知，在加入p53 DNA之后，有機氯農(nóng)藥DDE在213和288 nm處的特征吸收峰分別發(fā)生了15和11 nm的紅移，同時減色程度分別為63.8%和30.2%，并且在337 nm處出現(xiàn)等吸收點。而在加入Cmyc DNA之后，DDD的光譜信號變化最為顯著，其位于209和243 nm處的特征吸收峰分別減色55.8%和42.9%，209 nm處特征紫外吸收峰出現(xiàn)了8 nm的紅移，在298 nm處出現(xiàn)了等吸收點，而243 nm處特征吸收峰的位移不明顯。吸光度的顯著減弱以及吸收帶發(fā)生紅移都證實了有機氯農(nóng)藥分子嵌插入DNA的堿基對之間與DNA結合[17]，等吸收點的出現(xiàn)說明有機氯農(nóng)藥分子和DNA之間形成非共價復合物[18]。

3.3熒光競爭實驗比較有機氯農(nóng)藥分子與DNA作用的親合能力

溴化乙錠（EB）是一種具有共軛芳香環(huán)的平面分子，在TrisHCl緩沖溶液中，單獨的EB熒光非常弱，但它能平行地嵌入雙螺旋DNA的堿基對中，使熒光顯著增強。本實驗利用EB作為目標DNA的熒光探針，通過熒光競爭實驗研究有機氯農(nóng)藥分子與DNA嵌插作用的親合力。結果表明，隨著有機氯農(nóng)藥濃度不斷增加，DNAEB體系的熒光強度逐漸減弱，表明有機氯農(nóng)藥分子會和EB競爭與DNA結合于DNA的作用位點（圖3），使得嵌插在DNA堿基對中的EB不斷被置換出來。

小分子與DNA的相互作用有可能受多種作用的共同影響，通過在熒光光譜實驗中改變溶液的離子強度來判斷有機氯農(nóng)藥分子與DNA分子之間是否有靜電作用。溶液中離子強度的增加能夠抑制有機氯農(nóng)藥分子與DNA分子之間通過靜電作用相互結合，表現(xiàn)為熒光猝滅減弱。本實驗利用強電解質NaCl控制有機氯農(nóng)藥和DNA體系的離子強度，實驗見表3。由表3可知，在加入NaCl溶液后，有機氯農(nóng)藥與DNA溶液體系的熒光強度未增大反而減小，表明有機氯農(nóng)藥和DNA之間沒有靜電作用。雙鏈DNA之間由于磷酸基團帶有負電荷而產(chǎn)生靜電斥力，隨著離子強度增大，Na+中和了DNA磷酸根的負電荷，減弱了PO3+4之間的斥力，使DNA雙螺旋結構分子軸向收縮，表現(xiàn)為熒光強度的減小[22]。

靜態(tài)猝滅中，猝滅劑的存在不改變熒光分子激發(fā)態(tài)的壽命，動態(tài)猝滅中，猝滅劑的存在可導致其熒光壽命縮短。由表6可知，有機氯農(nóng)藥分子DDD和DDT在加入DNA前后熒光壽命變化較小，表明有DDD與DDT與DNA之間的猝滅模式為靜態(tài)猝滅，而隨著DNA的加入DDE的熒光壽命明顯增大，表明DDE與 DNA的溝區(qū)之間也有一定的相互作用[25]。

3.7圓二色譜研究有機氯農(nóng)藥分子對DNA結構的影響

小分子不僅能夠通過嵌插等作用影響DNA堿基對的堆積，而且能夠影響DNA的雙螺旋結構。CD譜中，260～280 nm處的正峰對應DNA堿基對堆積，245 nm處的負峰對應DNA雙螺旋結構的B型構象[26] 。當有小分子與DNA分子發(fā)生相互作用，影響DNA分子結構，其CD譜會發(fā)生變化。圖6為結合最為顯著的2種有機氯農(nóng)藥與相應DNA溶液的CD譜圖。對于p53 DNA，農(nóng)藥DDE的加入使得DNA正負峰都明顯減弱，這說明DDE的加入不但會削弱堿基對之間ππ堆積作用，而且影響了DNA的雙螺旋結構構象，會導致雙螺旋結構的松散甚至發(fā)生解鏈；而DDD和DDT對p53 DNA的CD譜沒有明顯影響。對于Cmyc DNA，農(nóng)藥DDD的加入使得DNA正負峰都發(fā)生減弱，這說明DDD的加入能夠削弱了Cmyc堿基對之間ππ堆積作用，并對其構象造成一定影響；DDT和DDE的加入使得Cmyc DNA負峰明顯減弱，說明對DNA的雙螺旋結構有較大影響。造成這種差異的原因是由于有機氯農(nóng)藥的毒性與其分子形狀和大小有關，Mullin的假設即強調了分子構型對分子毒性的影響[27]。DDT中的三氯甲基和DDE中雙鍵的空間位阻較大，抑制苯環(huán)平面結構的自由旋轉，不利于其分子以最優(yōu)的角度嵌插入DNA堿基對間[28]，影響了DNA雙螺旋B型構象。而DDD苯環(huán)平面結構能夠自由旋轉，有利于DDD嵌插入DNA堿基對，所以DDD能夠同時影響DNA的堿基對堆積和B型構象。

4結論

綜上所述，不同農(nóng)藥分子對DNA作用力大小存在顯著差異，其中DDD和p53 DNA結合能力最強，而與Cmyc DNA結合能力最弱，具有較為顯著的結合特異性。有機氯農(nóng)藥DDD、DDT、DDE都基本以嵌插方式與DNA發(fā)生作用，瞬態(tài)熒光實驗證明DDE與DNA雙螺旋的溝區(qū)也存在一定的相互作用。熱力學函數(shù)的計算結果表明有機氯農(nóng)藥分子和DNA之間的作用力類型主要存在疏水作用。CD實驗以及紫外升溫證明有機氯農(nóng)藥能夠影響DNA堿基對間的堆積作用或DNA雙螺旋結構，造成DNA穩(wěn)定性降低。這些影響可能是有機氯農(nóng)藥分子具有致癌作用的原因。

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