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    反相高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定母乳及奶粉中核苷和核苷酸的含量

    2014-10-24 21:49:47張婷婷等
    分析化學(xué) 2014年4期
    關(guān)鍵詞:液相色譜核苷核苷酸

    張婷婷等

    摘要:建立了反相高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定母乳和嬰幼兒奶粉中5種核苷和5種核苷酸含量的方法。樣品經(jīng)溫水溶解后,選擇0.5 %乙酸沉淀蛋白,并用超濾離心管離心過(guò)濾大分子物質(zhì);采用鍵合較長(zhǎng)碳鏈的Acclaim C30色譜柱為分析柱,以20 mmol/L醋酸銨和乙腈為流動(dòng)相,梯度洗脫分離,流速0.4 mL/min,溫度15 ℃,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm,采用電噴霧正離子模式進(jìn)行電離,選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè),外標(biāo)法定量分析。結(jié)果表明,核苷和核苷酸在12 min內(nèi)達(dá)到基線分離,在0.02~100 mg/L范圍內(nèi),線性關(guān)系好,相關(guān)系數(shù)R>0.999,方法檢出限0.1~0.2 ng,其中CMP, UMP, GMP, U, AMP在1, 10和50 mg/L加標(biāo)水平下的平均回收率在85.2%~104.7%之間,峰面積RSD在0.7 %~2.0%之間(n=6),核苷C, I , G , A和核苷酸IMP在0.5, 5和10 mg/L加標(biāo)水平下的平均回收率在85.08%~103.7%之間,峰面積RSD在0.6%~1.7%之間(n=6)。應(yīng)用本方法定性和定量分析母乳和嬰幼兒奶粉中核苷和核苷酸的含量,并且對(duì)紫外和質(zhì)譜測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較,基本一致。

    關(guān)鍵詞:液相色譜;質(zhì)譜;核苷;核苷酸;母乳;奶粉

    1引言

    核苷是由堿基加上環(huán)狀核糖或脫氧核糖組成,包括腺苷、鳥(niǎo)苷、胞苷、尿苷、肌苷等(圖1)。核苷與磷酸以酯鍵連成核苷酸,成為核酸的組成單位。研究表明,攝入適量的核苷和核苷酸能夠有效降低腹瀉的風(fēng)險(xiǎn)、保持體內(nèi)微生物環(huán)境的平衡、提高免疫功能和調(diào)控脂質(zhì)代謝等[1~4]。母乳中含有多種核苷和核苷酸,而牛奶中一般不含有核苷和核苷酸,因此許多奶制品公司將核苷酸作為重要的添加劑。臨床研究顯示,嬰幼兒奶粉中添加適量的核苷酸,有助于較小嬰兒腸胃的生長(zhǎng)發(fā)育[5]。目前,嬰幼兒奶粉中5種核苷酸(AMP, GMP, UMP, CMP和IMP)的含量有國(guó)際標(biāo)準(zhǔn),歐盟規(guī)定嬰兒食品中核苷酸的總含量不超過(guò)5 mg/100 kcal,而美國(guó)規(guī)定的含量上限為16 mg/100 kcal[6,7]。研究者希望深入研究母乳中各種核苷和核苷酸的含量,以此為基礎(chǔ),生產(chǎn)出各項(xiàng)指標(biāo)更加接近母乳的嬰幼兒奶粉,促進(jìn)嬰幼兒更健康地生長(zhǎng)。

    目前,測(cè)定核苷酸的方法包括熒光法[8]、毛細(xì)管電泳法[9,10]、離子交換色譜法[11]、反相高效液相色譜法(RPHPLC)[12]、液相色譜質(zhì)譜法[13~15]等。比色法易受干擾,操作比較復(fù)雜;毛細(xì)管電泳測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性不好;離子色譜分離核苷酸結(jié)果較好,受基質(zhì)干擾較少,但是流動(dòng)相與質(zhì)譜不兼容;液相色譜方法操作簡(jiǎn)單,分析速度快,重現(xiàn)性較好,但是核苷酸極性較強(qiáng),在常規(guī)反相色譜柱上保留較弱,而嬰幼兒奶粉基質(zhì)又比較復(fù)雜,容易受到基質(zhì)干擾[16]。

    本研究采用Acclaim C30色譜柱,其具有比C18填料更長(zhǎng)的疏水性碳鏈,對(duì)各種核苷和核苷酸具有更高的分辨率,同時(shí)增加了疏水性較弱的胞嘧啶核苷酸與色譜固定相的作用力,避免復(fù)雜基質(zhì)的干擾。以此為基礎(chǔ),建立了反相高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定5種核苷和5種核苷酸(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)的分析方法,并應(yīng)用于母乳和嬰幼兒奶粉的含量測(cè)定中。本方法快速,靈敏度高,適合于復(fù)雜基質(zhì)樣品的分析。

    3.5樣品測(cè)定

    按照2.4節(jié)樣品前處理和2.2節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定,外標(biāo)法定量分析。分別采用紫外和質(zhì)譜定量分析某品牌奶粉和母乳中核苷和核苷酸的含量,結(jié)果見(jiàn)表6,兩種方法的測(cè)定結(jié)果一致。結(jié)果表明,本方法快速、靈敏度高,可用于對(duì)母乳和嬰幼兒奶粉中核苷和核苷酸含量的測(cè)定,確保核苷和核苷酸在嬰幼兒奶粉中的添加量在合理范圍內(nèi),接近或達(dá)到母乳的功效。

    References

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