SRAP技術(shù)在植物遺傳育種中的應(yīng)用

盧超++張美德++何銀生等

摘要 相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性以其多態(tài)性、重復(fù)性、穩(wěn)定性較高，易于操作分析、高共顯性、易于分離條帶及測序等優(yōu)點(diǎn)，在植物遺傳育種中得到十分廣泛的應(yīng)用。分析SRAP標(biāo)記的原理、特點(diǎn)，對其在重要性狀的基因定位與克隆、QTL作圖、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定等方面的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)，并展望其在植物遺傳育種上的應(yīng)用前景，以促進(jìn)SRAP技術(shù)的應(yīng)用推廣。

關(guān)鍵詞 SRAP；遺傳育種；研究進(jìn)展；分子標(biāo)記

中圖分類號 Q344+.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2014）16-0018-02

分子標(biāo)記常用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因作圖和克隆以及植物遺傳育種中的分子標(biāo)記輔助選擇。根據(jù)檢測分析的方法，大部分分子標(biāo)記可以歸類為基于雜交或者PCR反應(yīng)的方法。RFLP是第1個(gè)基于雜交的分子標(biāo)記系統(tǒng)，并在當(dāng)時(shí)被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的研究。而諸如微陣列和多樣性序列芯片技術(shù)（DArT）是目前用于檢測單核苷酸多態(tài)性的主要技術(shù)，其也是基于雜交的分子標(biāo)記方法。同時(shí)，很多基于PCR的分子標(biāo)記方法被開發(fā)出來，這些標(biāo)記包括AFLP、RAPD、SSR、SRAP、ISSR以及SCAR等，通常用于基因組分析。這些分子標(biāo)記分析技術(shù)并不完美，都存在一些技術(shù)上的局限性。例如，RFLP標(biāo)記的探針在相關(guān)的物種中通用性比較好，在比較基因組學(xué)應(yīng)用方面相對其他的標(biāo)記有很大的優(yōu)勢。但是，RFLP在檢測程序方面過于復(fù)雜并且成本高，不易進(jìn)行成千上萬個(gè)體的自動(dòng)化分析用于分子標(biāo)記輔助選擇。

SRAP分子標(biāo)記是由加州大學(xué)的Li和Quiros[1]博士于2001年共同開發(fā)出來的，目的是為了擴(kuò)增開放閱讀框，通常又被稱作基于序列擴(kuò)增多態(tài)性（SBAP）[2]。作為一種新型基于 PCR的標(biāo)記系統(tǒng)，根據(jù)基因外顯子里GC含量豐富而啟動(dòng)子和內(nèi)含子里AT含量豐富的特點(diǎn)來設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，因不同個(gè)體的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性。由于SRAP標(biāo)記具有較多的優(yōu)點(diǎn)，如中等產(chǎn)量、簡便、重復(fù)性、高共顯性、易于分離條帶及測序等，且在基因組中均勻分布，已廣泛應(yīng)用于常規(guī)作物如小麥、水稻、棉花、油菜以及模式植物擬南芥的基因克隆與定位、種質(zhì)資源鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建等生物學(xué)研究。

1 SRAP技術(shù)的原理與特點(diǎn)

1.1 SRAP標(biāo)記的引物設(shè)計(jì)原理

SRAP標(biāo)記分析中共有2套引物，這些引物通常為17或者18個(gè)堿基長度并含有以下一些元件：首先是長度為13～14 bp核心序列元件，其5′端為10～11 bp的非特異性填充序列，緊隨其后的為CCGG（正向引物）或者AATT（反向引物）。核心序列后面為3個(gè)選擇性堿基，這3個(gè)堿基的變化能產(chǎn)生一系列引物，它們有著共同的核心序列。引物設(shè)計(jì)的原則為正向和反向引物的填充序列在組成上必須不同，長度為10～11 bp，引物之間不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或其他的二級結(jié)構(gòu)，GC的含量在40%～50%。

正向引物中的CCGG序列可以特異性結(jié)合ORF區(qū)域中的外顯子，而反向引物中的AATT序列特異結(jié)合于富含AT區(qū)的內(nèi)含子和啟動(dòng)子。這樣正反向引物結(jié)合可以同時(shí)對外顯子、內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增，并且因?yàn)閭€(gè)體不同及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子和間隔序列不同而產(chǎn)生多態(tài)性[3]。

1.2 SRAP擴(kuò)增程序及檢測方法

目前，SRAP標(biāo)記采用復(fù)性變溫法擴(kuò)增，主要有以下2種方法，第1種：由Li等在2001年建立，即94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)5次；94 ℃變性1 min，50 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5～10 min；4 ℃保存。前5個(gè)循環(huán)采用較低的退火溫度，有利于引物與靶序列更好的結(jié)合，隨后的35個(gè)循環(huán)采用50℃退火溫度，以保證擴(kuò)增產(chǎn)物以指數(shù)方式進(jìn)行有效的擴(kuò)增。第2種：由Budak等[4]提出，反應(yīng)條件基本不變，但反應(yīng)退火溫度保持47 ℃。2種方法均可得到穩(wěn)定性和重復(fù)較好的擴(kuò)增產(chǎn)物?？筛鶕?jù)試驗(yàn)?zāi)康摹⒉牧线M(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，以獲得較佳的試驗(yàn)效果。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用4%～6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，可用銀染技術(shù)檢測或同位素標(biāo)記，也可用1.8%～2.0% 瓊脂糖凝膠電泳分析多態(tài)性，但分辨率比較低。

2 SRAP技術(shù)在植物遺傳育種中的研究進(jìn)展

2.1 遺傳圖譜構(gòu)建

遺傳圖譜已廣泛應(yīng)用于基因作圖、QTL作圖以及全基因組序列的拼接組裝。在大多數(shù)應(yīng)用中，高密度分子標(biāo)記遺傳圖譜的構(gòu)建是必要的且具有很大優(yōu)勢。通過對SRAP引物熒光標(biāo)記，SRAP-PCR反應(yīng)能夠?qū)崿F(xiàn)多位點(diǎn)檢測的自動(dòng)化分析，因此使用SRAP技術(shù)構(gòu)建高密度遺傳圖譜是可行的。

在甘藍(lán)型油菜中，Sun等人利用‘6-FAM、‘VIC、‘Pet、‘NED以及‘LIZ五色熒光染料，使用ABI的遺傳分析儀進(jìn)行SRAP分析[5]。以‘LIZ作為內(nèi)參，而其他4種熒光染料被用來標(biāo)記SRAP引物，然后和未標(biāo)記的引物組合在一起。在使用4個(gè)熒光標(biāo)記和4個(gè)未標(biāo)記的引物擴(kuò)增得到SRAP產(chǎn)物后，來自4個(gè)SRAP引物組合的擴(kuò)增產(chǎn)物被混合到一起，從而使檢測通量增加了4倍。從12個(gè)熒光標(biāo)記和442個(gè)未熒光標(biāo)記的SRAP引物中選取了1 634個(gè)SRAP引物組合擴(kuò)增得到13 472個(gè)SRAP標(biāo)記。連同79個(gè)SSR標(biāo)記的結(jié)果，構(gòu)建了目前最為飽和的甘藍(lán)型油菜遺傳圖譜。Li等人采用cDNA-SRAP技術(shù)，首先構(gòu)建了基于甘藍(lán)型油菜葉片組織cDNAs的轉(zhuǎn)錄圖譜[6]。在cDNA-SRAP技術(shù)中，通過逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA后，一步法PCR能夠擴(kuò)增單鏈cDNAs。由于大多數(shù)的cDNA-SRAP標(biāo)記來源于基因序列間的差異，所以這些標(biāo)記通常被認(rèn)為是功能標(biāo)記。SRAP的擴(kuò)增產(chǎn)物很容易通過聚丙烯酰胺凝膠分離出來進(jìn)行測序，因此Li等人對190個(gè)分離的片段進(jìn)行測序，這些片段對應(yīng)了cDNA-SRAP的190個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。通過序列相似性分析，發(fā)現(xiàn)其中的169個(gè)序列片段同擬南芥中報(bào)道的基因具有同源性，這就允許根據(jù)基因?qū)虻谋葘龛b定2個(gè)物種基因組間廣泛的共線性。endprint

SRAP分子標(biāo)記技術(shù)也常常與其他的分子標(biāo)記相結(jié)合來構(gòu)建遺傳圖譜。在葫蘆科植物中，Yeboah等人采用SRAP和ISSR雙標(biāo)記構(gòu)建了黃瓜的遺傳圖譜[7]。他們通過對2個(gè)二倍體親本的雜交培育出了假測交F1分離群體，然后用164個(gè)SSR標(biāo)記和108個(gè)SRAP標(biāo)記一起分別構(gòu)建了父本和母本的遺傳圖譜。Zhang等人在黃瓜亞種間作圖群體里構(gòu)建了一個(gè)高密度共有遺傳圖譜。該圖譜包含了超過1 000個(gè)的分子標(biāo)記，其中有1 152個(gè)SSR標(biāo)記，192個(gè)SRAP標(biāo)記，21個(gè)SCAR標(biāo)記以及1個(gè)STS標(biāo)記[8]。對于多態(tài)性較低的物種，采用多個(gè)標(biāo)記對于構(gòu)建覆蓋全基因組的高密度遺傳圖譜是很有必要的。

2.2 QTL作圖

遺傳圖譜通常用于復(fù)雜性狀的的QTL作圖。由于QTL一般是由基因組中多基因所支撐，一般很難用標(biāo)記孟德爾位點(diǎn)的方法來標(biāo)記QTL。通常，如果一個(gè)復(fù)雜性狀能夠被轉(zhuǎn)換為一個(gè)簡單的孟德爾性狀，那么就有很多種策略可以用于孟德爾化基因的作圖和克隆。事實(shí)上，大多數(shù)QTL的克隆是通過培育近等基因系的孟德爾化方法完成的。但是，大多數(shù)的QTL不太容易孟德爾化，因此首先構(gòu)建遺傳圖譜，然后進(jìn)行QTL作圖是很有必要的。

在油菜中，Chen等人采用SRAP和SSR標(biāo)記在一個(gè)DH群體中構(gòu)建了遺傳圖譜，該群體是由一個(gè)黃籽油菜品系和一個(gè)傳統(tǒng)的油菜品系通過小孢子培養(yǎng)培育而成[9]。該研究采集了包括開花天數(shù)、含油量以及種子產(chǎn)量的3個(gè)復(fù)雜性狀在3個(gè)地點(diǎn)3年的數(shù)據(jù)并用于QTL作圖。對于含油量，在14個(gè)連鎖群鑒定了27個(gè)QTL；對于籽粒產(chǎn)量，在11個(gè)連鎖群鑒定了18個(gè)QTL；而對于開花天數(shù)，該研究表明，開花天數(shù)在作圖群體中是由單基因位點(diǎn)控制。Xu等人利用592個(gè)分子標(biāo)記，其中包括287個(gè)SRAP標(biāo)記、135個(gè)RAPD標(biāo)記、78個(gè)SSR標(biāo)記、49個(gè)ISSR標(biāo)記、29個(gè)RAMP標(biāo)記、14個(gè)RGA標(biāo)記，在蘿卜中構(gòu)建了一個(gè)遺傳圖譜[10]。利用這個(gè)遺傳圖譜進(jìn)行控制根部鎘積累的QTL分析，在1、4、6和9 4個(gè)連鎖群定位了4個(gè)QTL位點(diǎn)。在連鎖群9上的QTL是主要的一個(gè)，占表型變異的48.64%，暗示該QTL可以用于分子標(biāo)記輔助選擇，從而通過減低重金屬鎘的含量來改善蘿卜根部品質(zhì)。

2.3 種質(zhì)資源鑒定

劉 強(qiáng)等以17個(gè)水稻雜交種種子為試驗(yàn)材料，共組配25對SRAP引物組合進(jìn)行分析，篩選出12對條帶穩(wěn)定、多態(tài)性較好的引物組合[11]。利用這些引物組合進(jìn)行水稻雜交種鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物組合ME-6/EM-5產(chǎn)生15條多態(tài)性帶，可把17個(gè)雜交種區(qū)分為11類，引物組合ME-1/EM-2能把17個(gè)雜交種區(qū)分為11類。引物組合ME-1/EM-3在17個(gè)雜交種間的多態(tài)性最好，共產(chǎn)生清晰可見的譜帶28條，其中清晰可見的多態(tài)性片段21條，可把17個(gè)雜交種區(qū)分為17類。因此，SRAP技術(shù)可以較好的區(qū)分水稻雜交種，其結(jié)果比較準(zhǔn)確可靠。劉澤發(fā)等人以印度南瓜品種雜交種子為試驗(yàn)材料，應(yīng)用限制性位點(diǎn)擴(kuò)增多態(tài)性（RSAP）標(biāo)記、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）標(biāo)記鑒定其純度[12]。發(fā)現(xiàn)篩選出的引物R1R7、E1M5能夠很好地區(qū)分出錦栗二號、紅栗、紅栗二號、錦栗南瓜品種，利用RSAP分子標(biāo)記R1R7可檢測出錦栗雜交種子純度，分子標(biāo)記檢測結(jié)果與田間檢測結(jié)果吻合率達(dá)90%。

2.4 重要性狀的基因定位與克隆

SRAP技術(shù)在基因定位方面有一定的優(yōu)勢。由于SRAP可以使用無限的引物組合進(jìn)行檢測并且單個(gè)SRAP-PCR反應(yīng)就可以檢測多個(gè)位點(diǎn)，因此在基因定位方面SRAP技術(shù)相對于其他分子標(biāo)記方法具有很大的優(yōu)勢地位。在基因組中當(dāng)多個(gè)基因位點(diǎn)被快速篩選出來后，與目標(biāo)性狀緊密連鎖的SRAP標(biāo)記能夠很容易地被鑒定出來。

在一些研究中，SRAP標(biāo)記常被用于一些農(nóng)作物抗病性基因的定位。Chen等人利用SSR、SRAP以及TRAP標(biāo)記進(jìn)行了小麥抗條銹病基因的定位研究[13]。該研究使用400個(gè)SSR引物、315對SRAP引物以及40對TRAP引物來篩選F1、F2以及BC1作圖群體，從而構(gòu)建了一個(gè)精細(xì)的圖譜，該圖譜將抗性基因位點(diǎn)定位于染色體臂2AS側(cè)翼并且表明該抗性基因?qū)儆谛掳l(fā)現(xiàn)的抗性基因。在水稻中，Zhao等人搜索與一個(gè)水稻抗條紋葉枯病毒顯性基因（RSV1）相連鎖的SSR標(biāo)記，隨后又使用SRAP技術(shù)去尋找緊密連鎖的分子標(biāo)記，最終將RSV1定位到了兩翼為SSR和SRAP標(biāo)記的區(qū)域[14]。

3 問題與展望

理論上，分子標(biāo)記應(yīng)該具有多態(tài)性、穩(wěn)定性較好，在整個(gè)基因組中均勻分布的優(yōu)點(diǎn)，操作步驟簡單。但是，目前還沒有一種分子標(biāo)記技術(shù)同時(shí)具備以上優(yōu)點(diǎn)。SRAP標(biāo)記也同樣沒有兼具以上的各種優(yōu)點(diǎn)，主要原因就在于該技術(shù)是對ORFs擴(kuò)增，而著絲粒附近以及端?；蚪M相對較少，導(dǎo)致擴(kuò)增較少，若結(jié)合使用可擴(kuò)增這些區(qū)域的SSR標(biāo)記技術(shù)，以獲得覆蓋整個(gè)基因組的連鎖圖譜。

總之，SRAP作為一種簡單有效的方法在植物遺傳育種中應(yīng)用廣泛。在與其他分子標(biāo)記技術(shù)綜合應(yīng)用，能更加有效的構(gòu)建高密度遺傳圖譜，從而在種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析、基因的克隆與定位等方面進(jìn)行研究，以期在植物遺傳育種研究中發(fā)揮更大的作用。

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