高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中的斑蝥黃

楊姝麗+吳祥慶+黎小正+吳明媛+謝宗升+陳靜+秦振發(fā)+黃鸞玉

摘要：建立了一種高效液相色譜測定水產(chǎn)品中斑蝥黃的方法。樣品經(jīng)乙腈萃取，用乙腈和水為流動相，用液相色譜-紫外檢測器檢測，采用外標(biāo)法定量。該方法檢出限為10 μg/kg；斑蝥黃質(zhì)量濃度在0.02～10 μg/mL時線性良好，相關(guān)系數(shù)0.999 4；不同濃度的加標(biāo)回收率為90.1%～96.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.0%～4.2%（n=6）。該方法簡便、準(zhǔn)確，精密度良好，消耗少，適用于水產(chǎn)品中斑蝥黃殘留量的測定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；斑蝥黃；水產(chǎn)品

中圖分類號：O657.7+2 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0308-02

斑蝥黃（astaxanthin）化學(xué)名稱β-胡蘿卜素-4，4′-二酮，亦稱角黃素，分子式為C40H52O2。天然的斑蝥黃具有抗氧化、消除自由基的作用，在生物體內(nèi)的含量甚微。隨著人工合成斑蝥黃的工業(yè)化，其在飼料、食品、化工、醫(yī)藥等行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用^[1]。然而，近年來的研究結(jié)果表明，人體吸收斑蝥黃后會積累在視網(wǎng)膜上，從而造成視力減退等眼疾。為此，歐盟于2003年出臺法規(guī)將飼料中的斑蝥黃最高含量從原來的80 mg/kg降低到25 mg/kg^[2]。日本于2006年5月29日實施的“肯定列表制度”規(guī)定：禽蛋和豬、牛、水產(chǎn)品等動物源性食品中角黃素最大殘留限量為0.1 mg/kg。2008年我國農(nóng)業(yè)部1126公告即《飼料添加劑品種目錄》中規(guī)定，斑蝥黃被允許添加在家禽養(yǎng)殖飼料中，而不允許在水產(chǎn)飼料中添加。斑蝥黃重要用途之一是作為蛋黃著色劑飼喂產(chǎn)蛋家禽，使蛋黃變成人們喜愛的橙紅色，但不法商販將著色劑超量飼喂家禽現(xiàn)象依然存在。雖然在水產(chǎn)養(yǎng)殖中禁止使用斑蝥黃，但是由于其具有較好的著色效果，喂養(yǎng)后的魚類色澤更好、銷售價格更高，違規(guī)使用的現(xiàn)象較多。給水產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來了隱患。目前，斑蝥黃的檢測方法主要有色譜法^[3-6]、分光光度法^[7]、薄層色譜法^[8]，但主要是針對飼料或者家禽類產(chǎn)品。由于水產(chǎn)品的特殊性，在檢測技術(shù)上要求更高。本研究設(shè)立了水產(chǎn)品中斑蝥黃的高效液相色譜測定方法，有效消除了脂類及其他雜質(zhì)對待測物的干擾，降低了損耗，減少了有機溶劑用量，提高了回收率、準(zhǔn)確度和精密度。該方法滿足水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測的需要，對于應(yīng)對日本肯定列表制度，克服技術(shù)性貿(mào)易壁壘，增加出口，保護漁民和消費者權(quán)益具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo Accela PDA液相色譜儀（美國Thermo公司），配紫外檢測器；電子天平（瑞士梅特勒公司），感量0.000 1 g；SK3300LH超聲儀（上?？茖?dǎo)儀器公司）；TDD-4離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）；B-490旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（美國 BUCHI公司）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)斑蝥黃，純度≥98%，由德國Dr. Ehrenstorfer公司生產(chǎn)。乙腈為色譜純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。濾膜：0.22 μm。

1.2 斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液

準(zhǔn)確稱取斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg（精確到0.1 mg），用乙腈溶解，轉(zhuǎn)入容量瓶定容至100 mL，搖勻，配成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4 ℃以下避光保存，有效期3個月。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)中間液

準(zhǔn)確吸取斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，搖勻，配成濃度為10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。臨用前配制。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

在室溫下，分別取標(biāo)準(zhǔn)中間液0、10、20、50、100、200、500、1 000 μL，各置10 mL容量瓶中用乙腈稀釋定容，搖勻。該標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL。臨用前配制。

1.3 樣品前處理

稱取5 g均質(zhì)后的水產(chǎn)品樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，超聲提取2 min，勻漿提取30 s，以4 000 r/min離心5 min。另取一支50 mL離心管加10 mL乙腈，洗滌勻漿刀頭10 s，洗滌液移入前一離心管中，渦旋混合30 s，超聲提取 2 min，以4 000 r/min離心5 min；合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用乙腈定容至10 mL，過0.22 μm濾膜，待上機分析。

1.4 色譜分析條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm），流動相：A相為乙腈，B相為水，梯度洗脫程序見表1；流速：200 μL/min；柱溫：30 ℃；樣品盤溫度 15 ℃；進樣量：20 μL；檢測波長：475 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

在“1.4”節(jié)規(guī)定的色譜條件下，斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示，濃度為2.00 μg/mL。

2.7 方法檢出限

以空白水產(chǎn)品為基質(zhì)加標(biāo)，按照3倍信噪比（S/N≥3）估算最低檢出限，本方法檢測限為10 μg/kg。

3 結(jié)語

本研究采用乙腈萃取，流動相為乙腈和水，萃取率高，出峰快，峰形良好；該方法簡便，準(zhǔn)確度和精密度好，靈敏度高，檢出限低，滿足水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測分析的要求。

參考文獻：

[1]汪洪濤，徐學(xué)明，金征宇. 角黃素的性質(zhì)與開發(fā)應(yīng)用[J]. 糧食與飼料工業(yè)，2003（6）：31-32.

[2]EU. Animal Feed-Brighter Eyesight or Brighter Salmon？ Commission Decides New Rules on Colouring Feed Additive[EB/OL]. （2002-01-27）[2013-09-03]. http：//www.foodlaw.rdg.ac.uk/news/eu-03009.htm.

[3]Del Campo J A，Rodríguez H，Moreno J，et a1.Accumulation of astaxanthin and lutein in Chlorella zofingiensis （Chlorophyta）[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2004，64（6）：848-854.

[4]余孔捷，錢 疆，楊 方，等. 高效液相色譜法測定動物源性食品中角黃素、蝦青素的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（3）：145-148.

[5]王全林，史萍萍，張書芬，等. 反相高效液相色譜法同時測定咸鴨蛋黃中的斑蝥黃和蘇丹紅[J]. 色譜，2007，25（6）：864-866.

[6]張 華，馬 鑫，楊 鶯，等. 固相萃取-反高效液相色譜法同時測定飼料中角黃素和蝦青素[J]. 色譜，2008，26（3）：392-394.

[7]劉良忠，彭光華，王海濱，等. 天然紅心鴨蛋中紅色素的化學(xué)及光譜性質(zhì)研究[J]. 食品科學(xué)，2004，25（11）：265-268.

[8]Tolasa S，Cakli S，Ostermeyer U.Determination of astaxanthin and canthaxanthin in salmonid[J]. European Food Research and Technology，2005，221（6）：787-791.endprint

摘要：建立了一種高效液相色譜測定水產(chǎn)品中斑蝥黃的方法。樣品經(jīng)乙腈萃取，用乙腈和水為流動相，用液相色譜-紫外檢測器檢測，采用外標(biāo)法定量。該方法檢出限為10 μg/kg；斑蝥黃質(zhì)量濃度在0.02～10 μg/mL時線性良好，相關(guān)系數(shù)0.999 4；不同濃度的加標(biāo)回收率為90.1%～96.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.0%～4.2%（n=6）。該方法簡便、準(zhǔn)確，精密度良好，消耗少，適用于水產(chǎn)品中斑蝥黃殘留量的測定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；斑蝥黃；水產(chǎn)品

中圖分類號：O657.7+2 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0308-02

斑蝥黃（astaxanthin）化學(xué)名稱β-胡蘿卜素-4，4′-二酮，亦稱角黃素，分子式為C40H52O2。天然的斑蝥黃具有抗氧化、消除自由基的作用，在生物體內(nèi)的含量甚微。隨著人工合成斑蝥黃的工業(yè)化，其在飼料、食品、化工、醫(yī)藥等行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用^[1]。然而，近年來的研究結(jié)果表明，人體吸收斑蝥黃后會積累在視網(wǎng)膜上，從而造成視力減退等眼疾。為此，歐盟于2003年出臺法規(guī)將飼料中的斑蝥黃最高含量從原來的80 mg/kg降低到25 mg/kg^[2]。日本于2006年5月29日實施的“肯定列表制度”規(guī)定：禽蛋和豬、牛、水產(chǎn)品等動物源性食品中角黃素最大殘留限量為0.1 mg/kg。2008年我國農(nóng)業(yè)部1126公告即《飼料添加劑品種目錄》中規(guī)定，斑蝥黃被允許添加在家禽養(yǎng)殖飼料中，而不允許在水產(chǎn)飼料中添加。斑蝥黃重要用途之一是作為蛋黃著色劑飼喂產(chǎn)蛋家禽，使蛋黃變成人們喜愛的橙紅色，但不法商販將著色劑超量飼喂家禽現(xiàn)象依然存在。雖然在水產(chǎn)養(yǎng)殖中禁止使用斑蝥黃，但是由于其具有較好的著色效果，喂養(yǎng)后的魚類色澤更好、銷售價格更高，違規(guī)使用的現(xiàn)象較多。給水產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來了隱患。目前，斑蝥黃的檢測方法主要有色譜法^[3-6]、分光光度法^[7]、薄層色譜法^[8]，但主要是針對飼料或者家禽類產(chǎn)品。由于水產(chǎn)品的特殊性，在檢測技術(shù)上要求更高。本研究設(shè)立了水產(chǎn)品中斑蝥黃的高效液相色譜測定方法，有效消除了脂類及其他雜質(zhì)對待測物的干擾，降低了損耗，減少了有機溶劑用量，提高了回收率、準(zhǔn)確度和精密度。該方法滿足水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測的需要，對于應(yīng)對日本肯定列表制度，克服技術(shù)性貿(mào)易壁壘，增加出口，保護漁民和消費者權(quán)益具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo Accela PDA液相色譜儀（美國Thermo公司），配紫外檢測器；電子天平（瑞士梅特勒公司），感量0.000 1 g；SK3300LH超聲儀（上?？茖?dǎo)儀器公司）；TDD-4離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）；B-490旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（美國 BUCHI公司）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)斑蝥黃，純度≥98%，由德國Dr. Ehrenstorfer公司生產(chǎn)。乙腈為色譜純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。濾膜：0.22 μm。

1.2 斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液

準(zhǔn)確稱取斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg（精確到0.1 mg），用乙腈溶解，轉(zhuǎn)入容量瓶定容至100 mL，搖勻，配成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4 ℃以下避光保存，有效期3個月。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)中間液

準(zhǔn)確吸取斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，搖勻，配成濃度為10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。臨用前配制。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

在室溫下，分別取標(biāo)準(zhǔn)中間液0、10、20、50、100、200、500、1 000 μL，各置10 mL容量瓶中用乙腈稀釋定容，搖勻。該標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL。臨用前配制。

1.3 樣品前處理

稱取5 g均質(zhì)后的水產(chǎn)品樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，超聲提取2 min，勻漿提取30 s，以4 000 r/min離心5 min。另取一支50 mL離心管加10 mL乙腈，洗滌勻漿刀頭10 s，洗滌液移入前一離心管中，渦旋混合30 s，超聲提取 2 min，以4 000 r/min離心5 min；合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用乙腈定容至10 mL，過0.22 μm濾膜，待上機分析。

1.4 色譜分析條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm），流動相：A相為乙腈，B相為水，梯度洗脫程序見表1；流速：200 μL/min；柱溫：30 ℃；樣品盤溫度 15 ℃；進樣量：20 μL；檢測波長：475 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

在“1.4”節(jié)規(guī)定的色譜條件下，斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示，濃度為2.00 μg/mL。

2.7 方法檢出限

以空白水產(chǎn)品為基質(zhì)加標(biāo)，按照3倍信噪比（S/N≥3）估算最低檢出限，本方法檢測限為10 μg/kg。

3 結(jié)語

本研究采用乙腈萃取，流動相為乙腈和水，萃取率高，出峰快，峰形良好；該方法簡便，準(zhǔn)確度和精密度好，靈敏度高，檢出限低，滿足水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測分析的要求。

參考文獻：

[1]汪洪濤，徐學(xué)明，金征宇. 角黃素的性質(zhì)與開發(fā)應(yīng)用[J]. 糧食與飼料工業(yè)，2003（6）：31-32.

[2]EU. Animal Feed-Brighter Eyesight or Brighter Salmon？ Commission Decides New Rules on Colouring Feed Additive[EB/OL]. （2002-01-27）[2013-09-03]. http：//www.foodlaw.rdg.ac.uk/news/eu-03009.htm.

[3]Del Campo J A，Rodríguez H，Moreno J，et a1.Accumulation of astaxanthin and lutein in Chlorella zofingiensis （Chlorophyta）[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2004，64（6）：848-854.

[4]余孔捷，錢 疆，楊 方，等. 高效液相色譜法測定動物源性食品中角黃素、蝦青素的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（3）：145-148.

[5]王全林，史萍萍，張書芬，等. 反相高效液相色譜法同時測定咸鴨蛋黃中的斑蝥黃和蘇丹紅[J]. 色譜，2007，25（6）：864-866.

[6]張 華，馬 鑫，楊 鶯，等. 固相萃取-反高效液相色譜法同時測定飼料中角黃素和蝦青素[J]. 色譜，2008，26（3）：392-394.

[7]劉良忠，彭光華，王海濱，等. 天然紅心鴨蛋中紅色素的化學(xué)及光譜性質(zhì)研究[J]. 食品科學(xué)，2004，25（11）：265-268.

[8]Tolasa S，Cakli S，Ostermeyer U.Determination of astaxanthin and canthaxanthin in salmonid[J]. European Food Research and Technology，2005，221（6）：787-791.endprint

摘要：建立了一種高效液相色譜測定水產(chǎn)品中斑蝥黃的方法。樣品經(jīng)乙腈萃取，用乙腈和水為流動相，用液相色譜-紫外檢測器檢測，采用外標(biāo)法定量。該方法檢出限為10 μg/kg；斑蝥黃質(zhì)量濃度在0.02～10 μg/mL時線性良好，相關(guān)系數(shù)0.999 4；不同濃度的加標(biāo)回收率為90.1%～96.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.0%～4.2%（n=6）。該方法簡便、準(zhǔn)確，精密度良好，消耗少，適用于水產(chǎn)品中斑蝥黃殘留量的測定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；斑蝥黃；水產(chǎn)品

中圖分類號：O657.7+2 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0308-02

斑蝥黃（astaxanthin）化學(xué)名稱β-胡蘿卜素-4，4′-二酮，亦稱角黃素，分子式為C40H52O2。天然的斑蝥黃具有抗氧化、消除自由基的作用，在生物體內(nèi)的含量甚微。隨著人工合成斑蝥黃的工業(yè)化，其在飼料、食品、化工、醫(yī)藥等行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用^[1]。然而，近年來的研究結(jié)果表明，人體吸收斑蝥黃后會積累在視網(wǎng)膜上，從而造成視力減退等眼疾。為此，歐盟于2003年出臺法規(guī)將飼料中的斑蝥黃最高含量從原來的80 mg/kg降低到25 mg/kg^[2]。日本于2006年5月29日實施的“肯定列表制度”規(guī)定：禽蛋和豬、牛、水產(chǎn)品等動物源性食品中角黃素最大殘留限量為0.1 mg/kg。2008年我國農(nóng)業(yè)部1126公告即《飼料添加劑品種目錄》中規(guī)定，斑蝥黃被允許添加在家禽養(yǎng)殖飼料中，而不允許在水產(chǎn)飼料中添加。斑蝥黃重要用途之一是作為蛋黃著色劑飼喂產(chǎn)蛋家禽，使蛋黃變成人們喜愛的橙紅色，但不法商販將著色劑超量飼喂家禽現(xiàn)象依然存在。雖然在水產(chǎn)養(yǎng)殖中禁止使用斑蝥黃，但是由于其具有較好的著色效果，喂養(yǎng)后的魚類色澤更好、銷售價格更高，違規(guī)使用的現(xiàn)象較多。給水產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來了隱患。目前，斑蝥黃的檢測方法主要有色譜法^[3-6]、分光光度法^[7]、薄層色譜法^[8]，但主要是針對飼料或者家禽類產(chǎn)品。由于水產(chǎn)品的特殊性，在檢測技術(shù)上要求更高。本研究設(shè)立了水產(chǎn)品中斑蝥黃的高效液相色譜測定方法，有效消除了脂類及其他雜質(zhì)對待測物的干擾，降低了損耗，減少了有機溶劑用量，提高了回收率、準(zhǔn)確度和精密度。該方法滿足水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測的需要，對于應(yīng)對日本肯定列表制度，克服技術(shù)性貿(mào)易壁壘，增加出口，保護漁民和消費者權(quán)益具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo Accela PDA液相色譜儀（美國Thermo公司），配紫外檢測器；電子天平（瑞士梅特勒公司），感量0.000 1 g；SK3300LH超聲儀（上?？茖?dǎo)儀器公司）；TDD-4離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）；B-490旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（美國 BUCHI公司）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)斑蝥黃，純度≥98%，由德國Dr. Ehrenstorfer公司生產(chǎn)。乙腈為色譜純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。濾膜：0.22 μm。

1.2 斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液

準(zhǔn)確稱取斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg（精確到0.1 mg），用乙腈溶解，轉(zhuǎn)入容量瓶定容至100 mL，搖勻，配成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4 ℃以下避光保存，有效期3個月。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)中間液

準(zhǔn)確吸取斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，搖勻，配成濃度為10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。臨用前配制。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

在室溫下，分別取標(biāo)準(zhǔn)中間液0、10、20、50、100、200、500、1 000 μL，各置10 mL容量瓶中用乙腈稀釋定容，搖勻。該標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL。臨用前配制。

1.3 樣品前處理

稱取5 g均質(zhì)后的水產(chǎn)品樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，超聲提取2 min，勻漿提取30 s，以4 000 r/min離心5 min。另取一支50 mL離心管加10 mL乙腈，洗滌勻漿刀頭10 s，洗滌液移入前一離心管中，渦旋混合30 s，超聲提取 2 min，以4 000 r/min離心5 min；合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用乙腈定容至10 mL，過0.22 μm濾膜，待上機分析。

1.4 色譜分析條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm），流動相：A相為乙腈，B相為水，梯度洗脫程序見表1；流速：200 μL/min；柱溫：30 ℃；樣品盤溫度 15 ℃；進樣量：20 μL；檢測波長：475 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

在“1.4”節(jié)規(guī)定的色譜條件下，斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示，濃度為2.00 μg/mL。

2.7 方法檢出限

以空白水產(chǎn)品為基質(zhì)加標(biāo)，按照3倍信噪比（S/N≥3）估算最低檢出限，本方法檢測限為10 μg/kg。

3 結(jié)語

本研究采用乙腈萃取，流動相為乙腈和水，萃取率高，出峰快，峰形良好；該方法簡便，準(zhǔn)確度和精密度好，靈敏度高，檢出限低，滿足水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測分析的要求。

參考文獻：

[1]汪洪濤，徐學(xué)明，金征宇. 角黃素的性質(zhì)與開發(fā)應(yīng)用[J]. 糧食與飼料工業(yè)，2003（6）：31-32.

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