4種中藥復(fù)方對小鼠的免疫增強作用

管遠紅+張家禾+秦楓+周廣生+左偉勇

摘要：通過4種中藥復(fù)方對小鼠的脾臟指數(shù)、體重、腹腔巨噬細胞吞噬指數(shù)和吞噬率、溶血素、溶血空斑、淋巴細胞增殖、血清中一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、自然殺傷細胞（NK細胞）的影響作用，測得不同中藥復(fù)方與對照組的差異。結(jié)果表明，復(fù)方1對小鼠的脾臟指數(shù)、腹腔巨噬細胞吞噬率和吞噬指數(shù)、血液中溶血素水平差異顯著，復(fù)方2對小鼠的脾臟指數(shù)、腹腔巨噬細胞吞噬率、血液中溶血素和溶血空斑差異顯著；復(fù)方3對小鼠吞噬指數(shù)、血液中溶血素和溶血空斑、淋巴細胞增殖（ConA）差異顯著；復(fù)方4對小鼠的脾臟指數(shù)、腹腔巨噬細胞吞噬率和吞噬指數(shù)、血液中溶血素和溶血空斑、淋巴細胞增殖（LPS）、血液中NO和NK細胞均差異顯著。不同中藥復(fù)方中復(fù)方4的免疫增強作用最強。

關(guān)鍵詞：中藥復(fù)方；免疫增強；淋巴細胞增殖；溶血素

中圖分類號：S852.4 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0224-03

眾所周知，在治療多數(shù)疾病中，西藥作為常選藥物在治療重癥、急癥、疼痛性等疾病中發(fā)揮了不可替代的作用。但與中藥相比，西藥也表現(xiàn)出許多不足，新藥物的開發(fā)難度增加，對機體的刺激作用和傷害也不容忽視，在治療細菌性疾病時容易產(chǎn)生細菌耐藥性，在殺滅有害菌的同時對機體的有益菌也造成了不同程度的傷害，在治療病毒性疾病時表現(xiàn)力有所不足，尤其對新出現(xiàn)的病毒性疾病常常會在一段時間內(nèi)出現(xiàn)無治療藥物時期，比如SARS、H1N1、H7N9等疾病，在初發(fā)現(xiàn)時總是無特定的藥物治療，只有在一段時間后才有西藥的研發(fā)產(chǎn)品，這時人們往往想到的是中藥，如對板藍根的搶購。與西藥相比，中藥復(fù)方被廣泛用于病毒性傳染病的預(yù)防和治療^[1]。中國傳統(tǒng)中藥復(fù)方在數(shù)千年發(fā)展過程中，在保障人體和動物機體健康的過程中發(fā)揮了不可替代的作用，但新藥復(fù)方的研發(fā)相對比較緩慢。中藥復(fù)方除了有能夠治療慢性疾病、毒副作用小等優(yōu)點外，近年來相關(guān)學(xué)者提出中藥思維模式的研究，Lu等指出中藥模式可能導(dǎo)致革新^[2]。本試驗根據(jù)中藥復(fù)方的組方原則，選取多味中藥，制成4種復(fù)方制劑，研究各中藥復(fù)方的免疫增強作用。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

蒲公英、山銀花、淡竹葉、山楂、連翹、黨參、生姜、紅芪、三七、甘草、桔梗、黃連、梔子、丹皮、黃芪、赤芍、玄參、知母、石膏、水牛角、生地、金銀花、野菊花、紫花地丁、紫背天葵、黃芩、黃藥子、白藥子、大黃、浙貝母、防風(fēng)、蟬蛻、郁金、樸硝、喜炎平、木藍，試驗藥物均購自江蘇泰州市同仁堂藥店。

1.2 試劑與儀器

刀豆蛋白A（ConA）、脂多糖（LPS）、瑞氏染液、細胞培養(yǎng)板、小鼠淋巴細胞分離液、RPMI 1640液體培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、苯酚紅、酶標條、水解乳蛋白、細胞計數(shù)板、無菌脫纖維羊血等購自江蘇揚州科能生物科技有限公司；一氧化氮（NO）試劑盒、一氧化氮合酶（NOS）分型試劑盒購于南京建成生物工程研究所；自然殺傷細胞（NK細胞）酶免疫分析試劑盒購自上海橋杜商貿(mào)有限公司。U-2901型紫外、可見及近紅外分光光度計（日本HITACHI公司生產(chǎn)）、ELX800型酶標儀（美國Biotek公司生產(chǎn)）、NU-4750E型CO2培養(yǎng)箱（美國Nuaire公司生產(chǎn)）、RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)）、DW-20K調(diào)溫電熱器（上海蘇達實驗儀器有限公司生產(chǎn)）。

1.3 試驗動物

4～6周齡ICR小鼠，雌性各50%，購于揚州大學(xué)試驗動物中心。

1.4 組方原則

（1）八綱辨證：表里、寒熱、盛衰、虛實；（2）氣血津液辯證：氣行血，血以養(yǎng)津；（3）臟腑辯證：各臟及其腑；（4）三焦辯證：上焦、中焦、下焦；（5）因畜因地因時制宜：道法自然；（6）整體觀念：天人合一的思想；（7）陰陽組方：易經(jīng)；（8）多種治法綜合應(yīng)用：寒熱、補瀉、上下、走守、升降、表里、潤燥，根據(jù)以上原則將上述中藥組成復(fù)方1、復(fù)方2、復(fù)方3和復(fù)方4。

1.5 復(fù)方制劑

藥材與水比例1 g∶10mL過夜浸泡，武火煮沸后再文火保持微沸狀態(tài)2 h，過濾，再加入等量水提取，如此重復(fù)2次，合并濾液，各組方藥物均在冷凝回流條件提取下，提取液40～50 ℃ 濃縮為1 g生藥/mL，高壓蒸汽滅菌后4 ℃保存，備用。

1.6 脾臟指數(shù)和體重

試驗小鼠平均隨機分為5組，試驗組分別注射各復(fù)方制劑每只0.2 mL/d，連續(xù)腹腔注射14 d，對照組注射等量蒸餾水，脾臟指數(shù)計算公式：脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.7 4組復(fù)方對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響

小鼠分組與處理同“1.6”節(jié)，連續(xù)注射14 d，不同的是在第4天各試驗組注射0.2 mL 5%的綿羊紅細胞生理鹽水混懸液。試驗方法根據(jù)參考文獻[3]，給藥后15 d乙醚麻醉5組小鼠，腹腔消毒后注射生長液3 mL，后輕揉腹部5 min，接著注射1 mL 5%雞紅細胞，輕揉10 min后吸取腹腔液滴于載玻片，置濕盒內(nèi)在37 ℃恒溫孵育30～45 min，生理鹽水沖去浮著的細胞后常規(guī)瑞氏染色。根據(jù)公式計算吞噬細胞吞噬率和吞噬指數(shù)：吞噬率=吞噬雞紅細胞的吞噬細胞數(shù)/100個吞噬細胞×100%；吞噬指數(shù)=被吞噬的紅細胞數(shù)/100個吞噬細胞×100%。

1.8 4組復(fù)方對小鼠溶血素和溶血空斑的影響

小鼠分組與處理同“1.6”節(jié)，溶血素測定見文獻[3]，給藥后15 d摘眼球取血，離心分離血清，用生理鹽水1 ∶100稀釋后取1 mL，與5%綿羊紅細胞混懸液 0.5 mL和10%補體 0.5 mL 混勻，37 ℃溫育30 min，冰水中止反應(yīng)，以不加補體的空白管作對照，取上清液測540 nm處的吸光度（D540 nm），作為血清中溶血素的指標。endprint

溶血空斑測定參考文獻[4]，給藥后15 d斷頸處死小鼠，無菌采取脾臟，制取脾細胞懸液并調(diào)節(jié)濃度為5×106個/mL。取脾細胞混懸液0.5 mL加0.2%綿羊紅細胞混懸液和10%補體各0.5 mL，混勻，37 ℃溫育1 h，離心，以不加補體的空白管調(diào)零點。取上清液測540 nm處的吸光度（D540 nm），作為溶血空斑的指標。

1.9 淋巴細胞增殖測定

采用MTT比色法^[5]，小鼠斷頸處死，無菌取出脾臟，組織勻漿，加入淋巴細胞分離液，1 800 r/min，離心 25 min，吸取中間環(huán)狀乳白色淋巴細胞，Hanks液反復(fù)洗3次，用RPMI 1640營養(yǎng)液稀釋成5×106個/mL細胞的淋巴細胞懸液。細胞培養(yǎng)板中依次對照組（A）、復(fù)方1（B）、復(fù)方2（C）、復(fù)方3（D）、復(fù)方4（E）、RPMI 1640（F），1、2、3、4列加入ConA（終濃度為 5 μg/mL），5、6、7、8列加入LPS（終濃度為10 μg/mL），9、10、11、12列加入RPMI 1640，每孔各加100 μL。37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)68 h，加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸取上清液加入100 μL DMSO，微量振蕩器混勻，使其顏色變澄清，酶聯(lián)免疫儀檢測570 nm處的吸光度（D570 nm），作為淋巴細胞增殖的指標。

1.10 血清中NO、NOS、NK細胞測定

采用上述相關(guān)試劑盒測定。

1.11 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS軟件進行Duncans多重分析，以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 脾臟指數(shù)和體質(zhì)量變化

由表1可知，與對照組相比，4種中藥復(fù)方對小鼠的體質(zhì)量影響差異不顯著，復(fù)方3對小鼠的脾臟指數(shù)影響差異不顯著，復(fù)方1、復(fù)方2、復(fù)方4均對小鼠的脾臟指數(shù)有顯著影響。

疫器官質(zhì)量的增加可以在一定程度上反映機體的免疫能力^[6]，本研究中除復(fù)方3外，其余3種復(fù)方均能顯著增強小鼠的脾臟指數(shù)，但對小鼠的體質(zhì)量增加表現(xiàn)不明顯，與付秀華等報道的中藥可顯著增加小鼠脾臟指數(shù)，對增加體質(zhì)量作用不顯著^[7-8]一致。單核巨噬細胞的吞噬能力是衡量機體非特異性免疫功能的重要指標之一^[9]，巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)可以反映腹腔巨噬細胞吞噬能力的強弱，本研究中4種中藥復(fù)方都能夠增強小鼠的非特異性免疫。當(dāng)雞紅細胞作為外來抗原被注射入小鼠體內(nèi)時，小鼠機體特異性免疫系統(tǒng)則產(chǎn)生針對此種抗原的特異性抗體，在體外再次利用抗原與抗體在補體的作用下反應(yīng)，通過吸光值的大小反映機體的溶血素水平高低，得出4種復(fù)方對機體的特異性免疫水平影響。結(jié)果表明，4種復(fù)方均能夠顯著增強機體的溶血素水平，顯著增強特異性免疫能力。綿羊細胞溶解后即產(chǎn)生溶血空斑，溶血空斑可反映B細胞介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)^[10]，本研究中除復(fù)方1外，其余3種復(fù)方對溶血空斑的形成均有顯著作用。MTT法作為淋巴細胞增殖常用方法，本試驗采用此法測得經(jīng)ConA誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)中復(fù)方3差異顯著，經(jīng)LPS誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)中復(fù)方4差異顯著，結(jié)果表明，不同的誘導(dǎo)劑在淋巴細胞增殖試驗中產(chǎn)生不同的作用。本試驗中NO、NOS和NK細胞均采用的是商業(yè)性試劑盒測試，測試結(jié)果，4組復(fù)方作用結(jié)果NOS差異均不顯著，復(fù)方4顯著提高血清中NO，NK細胞差異較顯著，原因可能是受給藥劑量、藥材產(chǎn)地等的影響，據(jù)報道藥劑量、藥材產(chǎn)地會影響藥效，劉盛等在研究不同種質(zhì)板藍根和大青葉時，各種質(zhì)藥材樣品抗病毒活性的有無及強度有明顯差異^[11]，王遠閣通過試驗4種中藥多糖刺激細胞表達NOS并產(chǎn)生NO有一定的量效關(guān)系^[12]。綜上所述，復(fù)方4在4種中藥復(fù)方中的免疫增強作用最強。

陰陽和五行是傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑治療和預(yù)防疾病的核心依據(jù)^[13]，被用于解釋世界的變化，本研究中的重要復(fù)方在選方組方時嚴格遵循中醫(yī)的理論，所以取得了良好的增強小鼠免疫的效果。也有研究表明，復(fù)方中藥在治療疾病過程中，重要作用之一是眾多的藥材在體內(nèi)外使得機體的氧化應(yīng)激和氧化還原處于平衡^[14]，本試驗4種中藥復(fù)方對機體的氧化應(yīng)激和氧化還原之間平衡的機理還有待于進一步深入研究。

參考文獻：

[1]Li T，Peng T. Traditional Chinese herbal medicine as a source of molecules with antiviral activity[J]. Antiviral Res，2013，97（1）：1-9.

[2]Lu A P，Chen K J. Chinese medicine pattern diagnosis could lead to innovation in medical sciences[J]. Chin J Integr Med，2011，17（11）：811-817.

[3]傅圣斌，錢建鴻，陳樂意，等. 黃精多糖的提取及其對小鼠免疫活性的影響[J]. 中國食品學(xué)報，2013，13（1）：68-72.

[4]杜念興. 獸醫(yī)免疫學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：196-197.

[5]Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellar growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays[J]. J Immunol Methords，1983，65（1）：55-63.

[6]李贊陽，劉 紅，羅 燕，等. 不同組分、不同純度中藥復(fù)方多糖對小鼠免疫活性影響的研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（9）：181-184.

[7]付秀華. 中草藥組方對小鼠免疫功能的影響[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[8]劉翠艷. 獸醫(yī)中藥免疫增強劑的篩選試驗及其藥理學(xué)研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[9]龔非力. 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社醫(yī)學(xué)出版分社，2004.

[10]徐 坤，苗明三. 無花果多糖對氫化可的松致免疫抑制小鼠免疫功能的影響[J]. 中醫(yī)學(xué)報，2011，26（3）：324-325.

[11]劉 盛，陳萬生，喬傳卓，等. 不同種質(zhì)板藍根和大青葉的抗甲型流感病毒作用[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2000，21（3）：204-206.

[12]王遠閣. 4種中藥多糖免疫增強作用的研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[13]Liang F，Li L，Wang M，et al.Molecular network and chemical fragment-based characteristics of medicinal herbs with cold and hot properties from Chinese medicine[J]. J Ethnopharmacol，2013，148（3）：770-779.

[14]Wang Y，Ma L，Sun Y，et al. Metabonomics study on the hot syndrome of traditional Chinese medicine by rapid resolution liquid chromatography combined with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry[J]. Arch Pharm Res，2013. DOI：10.1007/s12272-013-0250-z.endprint

溶血空斑測定參考文獻[4]，給藥后15 d斷頸處死小鼠，無菌采取脾臟，制取脾細胞懸液并調(diào)節(jié)濃度為5×106個/mL。取脾細胞混懸液0.5 mL加0.2%綿羊紅細胞混懸液和10%補體各0.5 mL，混勻，37 ℃溫育1 h，離心，以不加補體的空白管調(diào)零點。取上清液測540 nm處的吸光度（D540 nm），作為溶血空斑的指標。

1.9 淋巴細胞增殖測定

采用MTT比色法^[5]，小鼠斷頸處死，無菌取出脾臟，組織勻漿，加入淋巴細胞分離液，1 800 r/min，離心 25 min，吸取中間環(huán)狀乳白色淋巴細胞，Hanks液反復(fù)洗3次，用RPMI 1640營養(yǎng)液稀釋成5×106個/mL細胞的淋巴細胞懸液。細胞培養(yǎng)板中依次對照組（A）、復(fù)方1（B）、復(fù)方2（C）、復(fù)方3（D）、復(fù)方4（E）、RPMI 1640（F），1、2、3、4列加入ConA（終濃度為 5 μg/mL），5、6、7、8列加入LPS（終濃度為10 μg/mL），9、10、11、12列加入RPMI 1640，每孔各加100 μL。37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)68 h，加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸取上清液加入100 μL DMSO，微量振蕩器混勻，使其顏色變澄清，酶聯(lián)免疫儀檢測570 nm處的吸光度（D570 nm），作為淋巴細胞增殖的指標。

1.10 血清中NO、NOS、NK細胞測定

采用上述相關(guān)試劑盒測定。

1.11 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS軟件進行Duncans多重分析，以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 脾臟指數(shù)和體質(zhì)量變化

由表1可知，與對照組相比，4種中藥復(fù)方對小鼠的體質(zhì)量影響差異不顯著，復(fù)方3對小鼠的脾臟指數(shù)影響差異不顯著，復(fù)方1、復(fù)方2、復(fù)方4均對小鼠的脾臟指數(shù)有顯著影響。

疫器官質(zhì)量的增加可以在一定程度上反映機體的免疫能力^[6]，本研究中除復(fù)方3外，其余3種復(fù)方均能顯著增強小鼠的脾臟指數(shù)，但對小鼠的體質(zhì)量增加表現(xiàn)不明顯，與付秀華等報道的中藥可顯著增加小鼠脾臟指數(shù)，對增加體質(zhì)量作用不顯著^[7-8]一致。單核巨噬細胞的吞噬能力是衡量機體非特異性免疫功能的重要指標之一^[9]，巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)可以反映腹腔巨噬細胞吞噬能力的強弱，本研究中4種中藥復(fù)方都能夠增強小鼠的非特異性免疫。當(dāng)雞紅細胞作為外來抗原被注射入小鼠體內(nèi)時，小鼠機體特異性免疫系統(tǒng)則產(chǎn)生針對此種抗原的特異性抗體，在體外再次利用抗原與抗體在補體的作用下反應(yīng)，通過吸光值的大小反映機體的溶血素水平高低，得出4種復(fù)方對機體的特異性免疫水平影響。結(jié)果表明，4種復(fù)方均能夠顯著增強機體的溶血素水平，顯著增強特異性免疫能力。綿羊細胞溶解后即產(chǎn)生溶血空斑，溶血空斑可反映B細胞介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)^[10]，本研究中除復(fù)方1外，其余3種復(fù)方對溶血空斑的形成均有顯著作用。MTT法作為淋巴細胞增殖常用方法，本試驗采用此法測得經(jīng)ConA誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)中復(fù)方3差異顯著，經(jīng)LPS誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)中復(fù)方4差異顯著，結(jié)果表明，不同的誘導(dǎo)劑在淋巴細胞增殖試驗中產(chǎn)生不同的作用。本試驗中NO、NOS和NK細胞均采用的是商業(yè)性試劑盒測試，測試結(jié)果，4組復(fù)方作用結(jié)果NOS差異均不顯著，復(fù)方4顯著提高血清中NO，NK細胞差異較顯著，原因可能是受給藥劑量、藥材產(chǎn)地等的影響，據(jù)報道藥劑量、藥材產(chǎn)地會影響藥效，劉盛等在研究不同種質(zhì)板藍根和大青葉時，各種質(zhì)藥材樣品抗病毒活性的有無及強度有明顯差異^[11]，王遠閣通過試驗4種中藥多糖刺激細胞表達NOS并產(chǎn)生NO有一定的量效關(guān)系^[12]。綜上所述，復(fù)方4在4種中藥復(fù)方中的免疫增強作用最強。

陰陽和五行是傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑治療和預(yù)防疾病的核心依據(jù)^[13]，被用于解釋世界的變化，本研究中的重要復(fù)方在選方組方時嚴格遵循中醫(yī)的理論，所以取得了良好的增強小鼠免疫的效果。也有研究表明，復(fù)方中藥在治療疾病過程中，重要作用之一是眾多的藥材在體內(nèi)外使得機體的氧化應(yīng)激和氧化還原處于平衡^[14]，本試驗4種中藥復(fù)方對機體的氧化應(yīng)激和氧化還原之間平衡的機理還有待于進一步深入研究。

參考文獻：

[1]Li T，Peng T. Traditional Chinese herbal medicine as a source of molecules with antiviral activity[J]. Antiviral Res，2013，97（1）：1-9.

[2]Lu A P，Chen K J. Chinese medicine pattern diagnosis could lead to innovation in medical sciences[J]. Chin J Integr Med，2011，17（11）：811-817.

[3]傅圣斌，錢建鴻，陳樂意，等. 黃精多糖的提取及其對小鼠免疫活性的影響[J]. 中國食品學(xué)報，2013，13（1）：68-72.

[4]杜念興. 獸醫(yī)免疫學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：196-197.

[5]Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellar growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays[J]. J Immunol Methords，1983，65（1）：55-63.

[6]李贊陽，劉 紅，羅 燕，等. 不同組分、不同純度中藥復(fù)方多糖對小鼠免疫活性影響的研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（9）：181-184.

[7]付秀華. 中草藥組方對小鼠免疫功能的影響[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[8]劉翠艷. 獸醫(yī)中藥免疫增強劑的篩選試驗及其藥理學(xué)研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[9]龔非力. 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社醫(yī)學(xué)出版分社，2004.

[10]徐 坤，苗明三. 無花果多糖對氫化可的松致免疫抑制小鼠免疫功能的影響[J]. 中醫(yī)學(xué)報，2011，26（3）：324-325.

[11]劉 盛，陳萬生，喬傳卓，等. 不同種質(zhì)板藍根和大青葉的抗甲型流感病毒作用[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2000，21（3）：204-206.

[12]王遠閣. 4種中藥多糖免疫增強作用的研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[13]Liang F，Li L，Wang M，et al.Molecular network and chemical fragment-based characteristics of medicinal herbs with cold and hot properties from Chinese medicine[J]. J Ethnopharmacol，2013，148（3）：770-779.

[14]Wang Y，Ma L，Sun Y，et al. Metabonomics study on the hot syndrome of traditional Chinese medicine by rapid resolution liquid chromatography combined with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry[J]. Arch Pharm Res，2013. DOI：10.1007/s12272-013-0250-z.endprint

溶血空斑測定參考文獻[4]，給藥后15 d斷頸處死小鼠，無菌采取脾臟，制取脾細胞懸液并調(diào)節(jié)濃度為5×106個/mL。取脾細胞混懸液0.5 mL加0.2%綿羊紅細胞混懸液和10%補體各0.5 mL，混勻，37 ℃溫育1 h，離心，以不加補體的空白管調(diào)零點。取上清液測540 nm處的吸光度（D540 nm），作為溶血空斑的指標。

1.9 淋巴細胞增殖測定

采用MTT比色法^[5]，小鼠斷頸處死，無菌取出脾臟，組織勻漿，加入淋巴細胞分離液，1 800 r/min，離心 25 min，吸取中間環(huán)狀乳白色淋巴細胞，Hanks液反復(fù)洗3次，用RPMI 1640營養(yǎng)液稀釋成5×106個/mL細胞的淋巴細胞懸液。細胞培養(yǎng)板中依次對照組（A）、復(fù)方1（B）、復(fù)方2（C）、復(fù)方3（D）、復(fù)方4（E）、RPMI 1640（F），1、2、3、4列加入ConA（終濃度為 5 μg/mL），5、6、7、8列加入LPS（終濃度為10 μg/mL），9、10、11、12列加入RPMI 1640，每孔各加100 μL。37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)68 h，加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸取上清液加入100 μL DMSO，微量振蕩器混勻，使其顏色變澄清，酶聯(lián)免疫儀檢測570 nm處的吸光度（D570 nm），作為淋巴細胞增殖的指標。

1.10 血清中NO、NOS、NK細胞測定

采用上述相關(guān)試劑盒測定。

1.11 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS軟件進行Duncans多重分析，以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 脾臟指數(shù)和體質(zhì)量變化

由表1可知，與對照組相比，4種中藥復(fù)方對小鼠的體質(zhì)量影響差異不顯著，復(fù)方3對小鼠的脾臟指數(shù)影響差異不顯著，復(fù)方1、復(fù)方2、復(fù)方4均對小鼠的脾臟指數(shù)有顯著影響。

疫器官質(zhì)量的增加可以在一定程度上反映機體的免疫能力^[6]，本研究中除復(fù)方3外，其余3種復(fù)方均能顯著增強小鼠的脾臟指數(shù)，但對小鼠的體質(zhì)量增加表現(xiàn)不明顯，與付秀華等報道的中藥可顯著增加小鼠脾臟指數(shù)，對增加體質(zhì)量作用不顯著^[7-8]一致。單核巨噬細胞的吞噬能力是衡量機體非特異性免疫功能的重要指標之一^[9]，巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)可以反映腹腔巨噬細胞吞噬能力的強弱，本研究中4種中藥復(fù)方都能夠增強小鼠的非特異性免疫。當(dāng)雞紅細胞作為外來抗原被注射入小鼠體內(nèi)時，小鼠機體特異性免疫系統(tǒng)則產(chǎn)生針對此種抗原的特異性抗體，在體外再次利用抗原與抗體在補體的作用下反應(yīng)，通過吸光值的大小反映機體的溶血素水平高低，得出4種復(fù)方對機體的特異性免疫水平影響。結(jié)果表明，4種復(fù)方均能夠顯著增強機體的溶血素水平，顯著增強特異性免疫能力。綿羊細胞溶解后即產(chǎn)生溶血空斑，溶血空斑可反映B細胞介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)^[10]，本研究中除復(fù)方1外，其余3種復(fù)方對溶血空斑的形成均有顯著作用。MTT法作為淋巴細胞增殖常用方法，本試驗采用此法測得經(jīng)ConA誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)中復(fù)方3差異顯著，經(jīng)LPS誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)中復(fù)方4差異顯著，結(jié)果表明，不同的誘導(dǎo)劑在淋巴細胞增殖試驗中產(chǎn)生不同的作用。本試驗中NO、NOS和NK細胞均采用的是商業(yè)性試劑盒測試，測試結(jié)果，4組復(fù)方作用結(jié)果NOS差異均不顯著，復(fù)方4顯著提高血清中NO，NK細胞差異較顯著，原因可能是受給藥劑量、藥材產(chǎn)地等的影響，據(jù)報道藥劑量、藥材產(chǎn)地會影響藥效，劉盛等在研究不同種質(zhì)板藍根和大青葉時，各種質(zhì)藥材樣品抗病毒活性的有無及強度有明顯差異^[11]，王遠閣通過試驗4種中藥多糖刺激細胞表達NOS并產(chǎn)生NO有一定的量效關(guān)系^[12]。綜上所述，復(fù)方4在4種中藥復(fù)方中的免疫增強作用最強。

陰陽和五行是傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑治療和預(yù)防疾病的核心依據(jù)^[13]，被用于解釋世界的變化，本研究中的重要復(fù)方在選方組方時嚴格遵循中醫(yī)的理論，所以取得了良好的增強小鼠免疫的效果。也有研究表明，復(fù)方中藥在治療疾病過程中，重要作用之一是眾多的藥材在體內(nèi)外使得機體的氧化應(yīng)激和氧化還原處于平衡^[14]，本試驗4種中藥復(fù)方對機體的氧化應(yīng)激和氧化還原之間平衡的機理還有待于進一步深入研究。

參考文獻：

[1]Li T，Peng T. Traditional Chinese herbal medicine as a source of molecules with antiviral activity[J]. Antiviral Res，2013，97（1）：1-9.

[2]Lu A P，Chen K J. Chinese medicine pattern diagnosis could lead to innovation in medical sciences[J]. Chin J Integr Med，2011，17（11）：811-817.

[3]傅圣斌，錢建鴻，陳樂意，等. 黃精多糖的提取及其對小鼠免疫活性的影響[J]. 中國食品學(xué)報，2013，13（1）：68-72.

[4]杜念興. 獸醫(yī)免疫學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：196-197.

[5]Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellar growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays[J]. J Immunol Methords，1983，65（1）：55-63.

[6]李贊陽，劉 紅，羅 燕，等. 不同組分、不同純度中藥復(fù)方多糖對小鼠免疫活性影響的研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（9）：181-184.

[7]付秀華. 中草藥組方對小鼠免疫功能的影響[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[8]劉翠艷. 獸醫(yī)中藥免疫增強劑的篩選試驗及其藥理學(xué)研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[9]龔非力. 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社醫(yī)學(xué)出版分社，2004.

[10]徐 坤，苗明三. 無花果多糖對氫化可的松致免疫抑制小鼠免疫功能的影響[J]. 中醫(yī)學(xué)報，2011，26（3）：324-325.

[11]劉 盛，陳萬生，喬傳卓，等. 不同種質(zhì)板藍根和大青葉的抗甲型流感病毒作用[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2000，21（3）：204-206.

[12]王遠閣. 4種中藥多糖免疫增強作用的研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[13]Liang F，Li L，Wang M，et al.Molecular network and chemical fragment-based characteristics of medicinal herbs with cold and hot properties from Chinese medicine[J]. J Ethnopharmacol，2013，148（3）：770-779.

[14]Wang Y，Ma L，Sun Y，et al. Metabonomics study on the hot syndrome of traditional Chinese medicine by rapid resolution liquid chromatography combined with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry[J]. Arch Pharm Res，2013. DOI：10.1007/s12272-013-0250-z.endprint