高原習(xí)服黃牛腦組織不同部位SLC25A6 mRNA絕對定量分析

王志強(qiáng)+俞紅賢+荊海霞+張勤文+魏青+梁林+牛亮

摘要：為研究SLC25A6 mRNA在高原習(xí)服黃牛腦組織中的表達(dá)量對能量利用的影響，建立用于SLC25A6基因絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率為E=104.9%，回歸系數(shù)r值為-0.996，斜率為-3.210，溶解曲線峰值單一；絕對定量檢測值表明，高原習(xí)服黃牛腦組織各部位SLC25A6 mRNA表達(dá)量總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SLC25A6 mRNA檢測值從高至低依次為小腦、海馬、枕葉、額葉、顳葉、頂葉，小腦SLC25A6基因表達(dá)量顯著高于其他各組織；頂葉表達(dá)量最低，小腦表達(dá)量為頂葉表達(dá)量的2.79倍；額葉、顳葉、頂葉之間差異，枕葉、海馬之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，高原習(xí)服黃牛腦組織中小腦耗能強(qiáng)度可能最大，細(xì)胞活動旺盛；相反頂葉耗能強(qiáng)度最低。

關(guān)鍵詞：高原習(xí)服黃牛；腦組織；線粒體；SLC25A6基因；ANT3；絕對定量

中圖分類號：S852.16+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0039-03

青藏高原平均海拔在4 500 m左右，大氣壓及氧分壓較低，高寒干燥、紫外輻射強(qiáng)度大，特殊的地理及氣候條件造就了特殊的生態(tài)環(huán)境；由于獨(dú)特的高原環(huán)境長期影響，使得土著動物及人類在機(jī)體各個(gè)方面形成了對高原環(huán)境的低氧適應(yīng)。機(jī)體獲取的氧氣最終通過線粒體被利用，糖類、脂肪、氨基酸在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中完成糖酵解過程后，通過線粒體的三羧酸循環(huán)及氧化磷酸化途徑，利用組織氧生成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），從而為機(jī)體提供能量。

動物及人由低海拔地區(qū)進(jìn)入高海拔地區(qū)后，機(jī)體會通過代償?shù)确绞絹磉m應(yīng)低氧環(huán)境，從而減輕缺氧初期出現(xiàn)的癥狀，促使機(jī)體產(chǎn)生高原習(xí)服。研究表明，哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)對氧分壓的改變極為敏感，腦組織不同區(qū)域會通過分子、細(xì)胞等各個(gè)水平的改變來適應(yīng)低氧^[1]。但急性低氧暴露仍會損傷腦組織，造成神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)散在性壞死等現(xiàn)象^[2]。急性重復(fù)性低氧刺激可使腦組織線粒體功能受到抑制，同時(shí)提高腦組織ATP相對水平^[3]。低氧預(yù)適應(yīng)能夠減輕腦組織缺血后海馬細(xì)胞凋亡數(shù)^[4]，提高線粒體的膜電位、減少線粒體活性氧及一氧化氮的產(chǎn)生^[5]，并通過降低線粒體通透性轉(zhuǎn)變的概率來減少細(xì)胞凋亡數(shù)^[6]。

研究表明，線粒體內(nèi)膜上的腺甘酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（adenine nucleotide translocator，ANT）能夠促進(jìn)胞質(zhì)和線粒體之間二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）與ATP的交換，使能量代謝順利進(jìn)行；而且ANT的4種異構(gòu)體均與細(xì)胞凋亡途徑有關(guān)^[7]，由SLC25A6基因編碼的線粒體內(nèi)膜蛋白ANT3表達(dá)量增高可引起線粒體膜通透性的改變，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡^[8-9]。

應(yīng)用絕對定量的方法，對高原習(xí)服黃牛SLC25A6 mRNA在腦組織不同部位的表達(dá)情況進(jìn)行研究，以期揭示低氧環(huán)境對高原習(xí)服黃牛腦組織不同部位能量代謝的影響，為哺乳動物低氧適應(yīng)的分子機(jī)制及高原醫(yī)學(xué)積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 動物來源及樣品處理

于青海省海晏縣（海拔3 000 m左右）選取臨床健康成年高原習(xí)服黃牛，頸動脈放血致死后，迅速取大腦額葉、顳葉、頂葉、枕葉、海馬及小腦皮層樣本，將其置于液氮中低溫保存，用于提取總RNA。

1.2 主要儀器與試劑

低溫高速離心機(jī)、普通PCR擴(kuò)增儀、核酸電泳儀、紫外凝膠成像儀、核酸蛋白檢測儀、real-time PCR擴(kuò)增儀；2×Taq PCR MasterMix（含染料）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，均購自北京索萊寶科技有限公司；TaKaRa SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、PMD19-T Vector，均購自寶生物工程（大連）有限公司；RNAsimple Total RNA Kti試劑盒、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒，均購自天根生化科技（北京）有限公司、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、EcoRⅠ，均購自上海生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 設(shè)計(jì)并合成引物 通過美國國家生物技術(shù)信息中心查詢普通牛（Bos taurus）SLC25A6基因的mRNA序列（NM_174660.2），根據(jù)其序列利用DNAMAN、Primer5設(shè)計(jì)特異性引物（表1），預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的基因片段長度為95 bp。引物設(shè)計(jì)后交由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.2 總RNA的提取及RT-PCR反應(yīng) 利用RNAsimple Total RNA Kti試劑盒，按照說明書步驟，提取高原習(xí)服黃?？俁NA。

1.3.3 絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.3.3.1 SLC25A6基因片段擴(kuò)增 以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)加樣體系如下：模板1 μL，濃度為10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，ddH2O2 10.5 μL，Solarbio 2×Taq PCR MasterMix（含染料）12.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s， 72 ℃ 延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 4 min充分延伸。產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3.2 克隆SLC25A6基因片段并驗(yàn)證 利用Solarbio 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，純化產(chǎn)物與PMD19-T Vector在 16 ℃條件下連接1 h。后經(jīng)42 ℃熱擊及冰浴等反應(yīng)與E.coil DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行連接，將菌液均勻涂布于含氨芐青霉素、半乳糖苷酶和異丙基硫代半乳糖苷的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃溫箱中培養(yǎng)12 h。挑取白色陽性單菌落，接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12 h。利用通用引物對菌液進(jìn)行PCR初步鑒定后，對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序以進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.3.3.3 質(zhì)粒DNA抽提、酶切及純化 利用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒對鑒定正確的陽性菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取。通過EcoRⅠ對抽提的質(zhì)粒進(jìn)行酶切37 ℃孵育1 h后，65 ℃ 20 min 使酶失活。將酶切好的質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并利用solarbio 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對目標(biāo)DNA條帶進(jìn)行回收純化，從而去除酶切不完全的環(huán)狀質(zhì)粒。

1.3.3.4 質(zhì)粒DNA濃度測定及梯度稀釋 利用核酸蛋白檢測儀對純化后的線性質(zhì)粒進(jìn)行濃度測定。根據(jù)公式：質(zhì)?？截悢?shù)（拷貝數(shù)/μL）=6.02×1023（拷貝數(shù)/mol） ×質(zhì)粒濃度（g/μL）/質(zhì)粒分子量（g/mol），得出質(zhì)?？截悢?shù)，然后將質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別稀釋成1×108～1×102拷貝數(shù)/μL的7個(gè)梯度，作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.4 real-time PCR反應(yīng) real-time PCR擴(kuò)增反應(yīng)的加樣體系如下：模板2 μL，濃度為10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，ddH2O2 8.5 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。首先將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA上機(jī)后進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，使cDNA由單鏈變?yōu)殡p鏈，后與標(biāo)準(zhǔn)品一同進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。待測樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA檢測結(jié)果

利用BIO-RAD核酸蛋白檢測儀測定RNA純度及濃度，測定結(jié)果見表2，各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求。凝膠電泳檢測結(jié)果見圖1，泳道自左至右以此為：額葉、顳葉、頂葉、枕葉、小腦及海馬，18S及28S條帶清晰，并無降解現(xiàn)象出現(xiàn)。

2.4 高原習(xí)服黃牛腦組織內(nèi)SLC25A6基因mRNA表達(dá)量

通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)，20 μL的反轉(zhuǎn)錄體系中共加入了1 μg的總RNA，而進(jìn)行Real-time PCR時(shí)，反應(yīng)體系中加入了2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中CT值與基因拷貝數(shù)的關(guān)系，換算出SLC25A6基因在總RNA/μg中的絕對表達(dá)量。高原習(xí)服黃牛腦組織內(nèi)SLC25A6基因mRNA表達(dá)量見表3、圖5。高原習(xí)服黃牛腦組織中小腦SLC25A6基因表達(dá)量最高，拷貝數(shù)均值為3.683×107拷貝數(shù)/μg，顯著高于其他各組織；頂葉表達(dá)量最低，小腦表達(dá)量為頂葉表達(dá)量的2.79倍；顳葉與枕葉、海馬表達(dá)量均值之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；頂葉與枕葉、海馬表達(dá)量均值之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；額葉、顳葉、頂葉均值之間差異，枕葉與海馬之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

度地利用氧，并產(chǎn)生盡可能多的能量；腦組織的缺氧適應(yīng)能夠使損壞腦細(xì)胞的不良因素得到抑制或調(diào)整，使腦組織在不良環(huán)境下度過危險(xiǎn)期^[10]。ANT在能量代謝中發(fā)揮著重要作用，本試驗(yàn)通過測定SLC25A6基因在高原習(xí)服黃牛腦組織中的表達(dá)情況，間接反映腦組織不同部位在高原低氧習(xí)服情況下對能量的利用情況。

由于反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為單鏈，而標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為雙鏈，所以進(jìn)行Real-time PCR時(shí)，先將cDNA進(jìn)行1個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，使其變?yōu)殡p鏈，后與標(biāo)準(zhǔn)品一同進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，以避免單鏈與雙鏈之間的差異^[11]。試驗(yàn)結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率為E=104.9%，回歸系數(shù)r=-0.996，斜率為-3.210，溶解曲線峰值單一。從這些參數(shù)可以看出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，引物特異性較強(qiáng)。結(jié)果能夠真實(shí)反映出SLC25A6基因在高原習(xí)服黃牛腦組織中的實(shí)際拷貝數(shù)。

本研究結(jié)果表明，在高原習(xí)服黃牛腦組織中SLC25A6基因的表達(dá)量從高到低依次為小腦、海馬、枕葉、額葉、顳葉、頂葉，小腦表達(dá)量顯著高于其組織，小腦SLC25A6基因表達(dá)量為額葉表達(dá)量的2.79倍。頂葉消耗能量強(qiáng)度較低，細(xì)胞能量代謝較弱，小腦消耗能量強(qiáng)度較大，細(xì)胞能量代謝較強(qiáng)?？梢酝茢囗斎~為低氧環(huán)境敏感區(qū)域，小腦抗低氧能力較強(qiáng)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Pea F，Ramirez J M. Hypoxia-induced changes in neuronal network properties[J]. Molecular Neurobiology，2005，32（3）：251-283.

[2]胡定煜，李 浡，戴榮繼，等. 常壓低氧下Wistar大鼠腦組織中HIF-1α表達(dá)與腦損傷[J]. 化學(xué)通報(bào)，2010，73（11）：1030-1034.

[3]謝勝男，李 昕，李堯華，等. 急性重復(fù)低氧對小鼠腦組織血氧飽和度、線粒體功能以及ATP水平的影響[J]. 中國病理生理雜志，2008，24（4）：755-758.

[4]齊 晶，閔連秋.低氧預(yù)處理對缺血腦組織p53表達(dá)的影響[J]. 牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，29（1）：34-36.

[5]Plotnikov E Y，Kazachenko A V，Vyssokikh M Y，et al. The role of mitochondria in oxidative and nitrosative stress during ischemia/reperfusion in the rat kidney[J]. Kidney International，2007，72（12）：1493-1502.

[6]Hausenloy D J，Yellon D M，Mani-Babu S，et al. Preconditioning protects by inhibiting the mitochondrial permeability transition[J]. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology，2004，287（2）：841-849.

[7]Gallerne C，Touat Z，Chen Z X，et al. The fourth isoform of the adenine nucleotide translocator inhibits mitochondrial apoptosis in cancer cells[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2010，42（5）：623-629.

[8]蘭春慧，房殿春，樊麗琳，等. 線粒體內(nèi)膜蛋白ANT在幽門螺桿菌致胃癌細(xì)胞凋亡中的表達(dá)[J]. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2009，18（2）：100-102.

[9]Zamora M，Granell M，Mampel T，et al. Adenine nucleotide translocase 3（ANT3） overexpression induces apoptosis in cultured cells[J]. FEBS Letters，2004，563（1/2/3）：155-160.

[10]崔秀玉，呂國蔚. 腦缺氧和腦缺氧適應(yīng)時(shí)能量代謝的變化[J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，17（2）：153-155.

[11]李 麗，趙成萍，李 宏，等. 質(zhì)粒制備絕對定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方法的建立[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，19（6）：1157-1162.

1.3.3.3 質(zhì)粒DNA抽提、酶切及純化 利用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒對鑒定正確的陽性菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取。通過EcoRⅠ對抽提的質(zhì)粒進(jìn)行酶切37 ℃孵育1 h后，65 ℃ 20 min 使酶失活。將酶切好的質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并利用solarbio 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對目標(biāo)DNA條帶進(jìn)行回收純化，從而去除酶切不完全的環(huán)狀質(zhì)粒。

1.3.3.4 質(zhì)粒DNA濃度測定及梯度稀釋 利用核酸蛋白檢測儀對純化后的線性質(zhì)粒進(jìn)行濃度測定。根據(jù)公式：質(zhì)?？截悢?shù)（拷貝數(shù)/μL）=6.02×1023（拷貝數(shù)/mol） ×質(zhì)粒濃度（g/μL）/質(zhì)粒分子量（g/mol），得出質(zhì)粒拷貝數(shù)，然后將質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別稀釋成1×108～1×102拷貝數(shù)/μL的7個(gè)梯度，作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.4 real-time PCR反應(yīng) real-time PCR擴(kuò)增反應(yīng)的加樣體系如下：模板2 μL，濃度為10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，ddH2O2 8.5 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。首先將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA上機(jī)后進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，使cDNA由單鏈變?yōu)殡p鏈，后與標(biāo)準(zhǔn)品一同進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。待測樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA檢測結(jié)果

利用BIO-RAD核酸蛋白檢測儀測定RNA純度及濃度，測定結(jié)果見表2，各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求。凝膠電泳檢測結(jié)果見圖1，泳道自左至右以此為：額葉、顳葉、頂葉、枕葉、小腦及海馬，18S及28S條帶清晰，并無降解現(xiàn)象出現(xiàn)。

2.4 高原習(xí)服黃牛腦組織內(nèi)SLC25A6基因mRNA表達(dá)量

通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)，20 μL的反轉(zhuǎn)錄體系中共加入了1 μg的總RNA，而進(jìn)行Real-time PCR時(shí)，反應(yīng)體系中加入了2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中CT值與基因拷貝數(shù)的關(guān)系，換算出SLC25A6基因在總RNA/μg中的絕對表達(dá)量。高原習(xí)服黃牛腦組織內(nèi)SLC25A6基因mRNA表達(dá)量見表3、圖5。高原習(xí)服黃牛腦組織中小腦SLC25A6基因表達(dá)量最高，拷貝數(shù)均值為3.683×107拷貝數(shù)/μg，顯著高于其他各組織；頂葉表達(dá)量最低，小腦表達(dá)量為頂葉表達(dá)量的2.79倍；顳葉與枕葉、海馬表達(dá)量均值之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；頂葉與枕葉、海馬表達(dá)量均值之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；額葉、顳葉、頂葉均值之間差異，枕葉與海馬之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

度地利用氧，并產(chǎn)生盡可能多的能量；腦組織的缺氧適應(yīng)能夠使損壞腦細(xì)胞的不良因素得到抑制或調(diào)整，使腦組織在不良環(huán)境下度過危險(xiǎn)期^[10]。ANT在能量代謝中發(fā)揮著重要作用，本試驗(yàn)通過測定SLC25A6基因在高原習(xí)服黃牛腦組織中的表達(dá)情況，間接反映腦組織不同部位在高原低氧習(xí)服情況下對能量的利用情況。

由于反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為單鏈，而標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為雙鏈，所以進(jìn)行Real-time PCR時(shí)，先將cDNA進(jìn)行1個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，使其變?yōu)殡p鏈，后與標(biāo)準(zhǔn)品一同進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，以避免單鏈與雙鏈之間的差異^[11]。試驗(yàn)結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率為E=104.9%，回歸系數(shù)r=-0.996，斜率為-3.210，溶解曲線峰值單一。從這些參數(shù)可以看出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，引物特異性較強(qiáng)。結(jié)果能夠真實(shí)反映出SLC25A6基因在高原習(xí)服黃牛腦組織中的實(shí)際拷貝數(shù)。

本研究結(jié)果表明，在高原習(xí)服黃牛腦組織中SLC25A6基因的表達(dá)量從高到低依次為小腦、海馬、枕葉、額葉、顳葉、頂葉，小腦表達(dá)量顯著高于其組織，小腦SLC25A6基因表達(dá)量為額葉表達(dá)量的2.79倍。頂葉消耗能量強(qiáng)度較低，細(xì)胞能量代謝較弱，小腦消耗能量強(qiáng)度較大，細(xì)胞能量代謝較強(qiáng)。可以推斷頂葉為低氧環(huán)境敏感區(qū)域，小腦抗低氧能力較強(qiáng)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Pea F，Ramirez J M. Hypoxia-induced changes in neuronal network properties[J]. Molecular Neurobiology，2005，32（3）：251-283.

[2]胡定煜，李 浡，戴榮繼，等. 常壓低氧下Wistar大鼠腦組織中HIF-1α表達(dá)與腦損傷[J]. 化學(xué)通報(bào)，2010，73（11）：1030-1034.

[3]謝勝男，李 昕，李堯華，等. 急性重復(fù)低氧對小鼠腦組織血氧飽和度、線粒體功能以及ATP水平的影響[J]. 中國病理生理雜志，2008，24（4）：755-758.

[4]齊 晶，閔連秋.低氧預(yù)處理對缺血腦組織p53表達(dá)的影響[J]. 牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，29（1）：34-36.

[5]Plotnikov E Y，Kazachenko A V，Vyssokikh M Y，et al. The role of mitochondria in oxidative and nitrosative stress during ischemia/reperfusion in the rat kidney[J]. Kidney International，2007，72（12）：1493-1502.

[6]Hausenloy D J，Yellon D M，Mani-Babu S，et al. Preconditioning protects by inhibiting the mitochondrial permeability transition[J]. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology，2004，287（2）：841-849.

[7]Gallerne C，Touat Z，Chen Z X，et al. The fourth isoform of the adenine nucleotide translocator inhibits mitochondrial apoptosis in cancer cells[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2010，42（5）：623-629.

[8]蘭春慧，房殿春，樊麗琳，等. 線粒體內(nèi)膜蛋白ANT在幽門螺桿菌致胃癌細(xì)胞凋亡中的表達(dá)[J]. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2009，18（2）：100-102.

[9]Zamora M，Granell M，Mampel T，et al. Adenine nucleotide translocase 3（ANT3） overexpression induces apoptosis in cultured cells[J]. FEBS Letters，2004，563（1/2/3）：155-160.

[10]崔秀玉，呂國蔚. 腦缺氧和腦缺氧適應(yīng)時(shí)能量代謝的變化[J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，17（2）：153-155.

[11]李 麗，趙成萍，李 宏，等. 質(zhì)粒制備絕對定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方法的建立[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，19（6）：1157-1162.

1.3.3.3 質(zhì)粒DNA抽提、酶切及純化 利用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒對鑒定正確的陽性菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取。通過EcoRⅠ對抽提的質(zhì)粒進(jìn)行酶切37 ℃孵育1 h后，65 ℃ 20 min 使酶失活。將酶切好的質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并利用solarbio 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對目標(biāo)DNA條帶進(jìn)行回收純化，從而去除酶切不完全的環(huán)狀質(zhì)粒。

1.3.3.4 質(zhì)粒DNA濃度測定及梯度稀釋 利用核酸蛋白檢測儀對純化后的線性質(zhì)粒進(jìn)行濃度測定。根據(jù)公式：質(zhì)?？截悢?shù)（拷貝數(shù)/μL）=6.02×1023（拷貝數(shù)/mol） ×質(zhì)粒濃度（g/μL）/質(zhì)粒分子量（g/mol），得出質(zhì)?？截悢?shù)，然后將質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別稀釋成1×108～1×102拷貝數(shù)/μL的7個(gè)梯度，作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.4 real-time PCR反應(yīng) real-time PCR擴(kuò)增反應(yīng)的加樣體系如下：模板2 μL，濃度為10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，ddH2O2 8.5 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。首先將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA上機(jī)后進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，使cDNA由單鏈變?yōu)殡p鏈，后與標(biāo)準(zhǔn)品一同進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。待測樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA檢測結(jié)果

利用BIO-RAD核酸蛋白檢測儀測定RNA純度及濃度，測定結(jié)果見表2，各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求。凝膠電泳檢測結(jié)果見圖1，泳道自左至右以此為：額葉、顳葉、頂葉、枕葉、小腦及海馬，18S及28S條帶清晰，并無降解現(xiàn)象出現(xiàn)。

2.4 高原習(xí)服黃牛腦組織內(nèi)SLC25A6基因mRNA表達(dá)量

通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)，20 μL的反轉(zhuǎn)錄體系中共加入了1 μg的總RNA，而進(jìn)行Real-time PCR時(shí)，反應(yīng)體系中加入了2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中CT值與基因拷貝數(shù)的關(guān)系，換算出SLC25A6基因在總RNA/μg中的絕對表達(dá)量。高原習(xí)服黃牛腦組織內(nèi)SLC25A6基因mRNA表達(dá)量見表3、圖5。高原習(xí)服黃牛腦組織中小腦SLC25A6基因表達(dá)量最高，拷貝數(shù)均值為3.683×107拷貝數(shù)/μg，顯著高于其他各組織；頂葉表達(dá)量最低，小腦表達(dá)量為頂葉表達(dá)量的2.79倍；顳葉與枕葉、海馬表達(dá)量均值之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；頂葉與枕葉、海馬表達(dá)量均值之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；額葉、顳葉、頂葉均值之間差異，枕葉與海馬之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

度地利用氧，并產(chǎn)生盡可能多的能量；腦組織的缺氧適應(yīng)能夠使損壞腦細(xì)胞的不良因素得到抑制或調(diào)整，使腦組織在不良環(huán)境下度過危險(xiǎn)期^[10]。ANT在能量代謝中發(fā)揮著重要作用，本試驗(yàn)通過測定SLC25A6基因在高原習(xí)服黃牛腦組織中的表達(dá)情況，間接反映腦組織不同部位在高原低氧習(xí)服情況下對能量的利用情況。

由于反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為單鏈，而標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為雙鏈，所以進(jìn)行Real-time PCR時(shí)，先將cDNA進(jìn)行1個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，使其變?yōu)殡p鏈，后與標(biāo)準(zhǔn)品一同進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，以避免單鏈與雙鏈之間的差異^[11]。試驗(yàn)結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率為E=104.9%，回歸系數(shù)r=-0.996，斜率為-3.210，溶解曲線峰值單一。從這些參數(shù)可以看出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，引物特異性較強(qiáng)。結(jié)果能夠真實(shí)反映出SLC25A6基因在高原習(xí)服黃牛腦組織中的實(shí)際拷貝數(shù)。

本研究結(jié)果表明，在高原習(xí)服黃牛腦組織中SLC25A6基因的表達(dá)量從高到低依次為小腦、海馬、枕葉、額葉、顳葉、頂葉，小腦表達(dá)量顯著高于其組織，小腦SLC25A6基因表達(dá)量為額葉表達(dá)量的2.79倍。頂葉消耗能量強(qiáng)度較低，細(xì)胞能量代謝較弱，小腦消耗能量強(qiáng)度較大，細(xì)胞能量代謝較強(qiáng)?？梢酝茢囗斎~為低氧環(huán)境敏感區(qū)域，小腦抗低氧能力較強(qiáng)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Pea F，Ramirez J M. Hypoxia-induced changes in neuronal network properties[J]. Molecular Neurobiology，2005，32（3）：251-283.

[2]胡定煜，李 浡，戴榮繼，等. 常壓低氧下Wistar大鼠腦組織中HIF-1α表達(dá)與腦損傷[J]. 化學(xué)通報(bào)，2010，73（11）：1030-1034.

[3]謝勝男，李 昕，李堯華，等. 急性重復(fù)低氧對小鼠腦組織血氧飽和度、線粒體功能以及ATP水平的影響[J]. 中國病理生理雜志，2008，24（4）：755-758.

[4]齊 晶，閔連秋.低氧預(yù)處理對缺血腦組織p53表達(dá)的影響[J]. 牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，29（1）：34-36.

[5]Plotnikov E Y，Kazachenko A V，Vyssokikh M Y，et al. The role of mitochondria in oxidative and nitrosative stress during ischemia/reperfusion in the rat kidney[J]. Kidney International，2007，72（12）：1493-1502.

[6]Hausenloy D J，Yellon D M，Mani-Babu S，et al. Preconditioning protects by inhibiting the mitochondrial permeability transition[J]. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology，2004，287（2）：841-849.

[7]Gallerne C，Touat Z，Chen Z X，et al. The fourth isoform of the adenine nucleotide translocator inhibits mitochondrial apoptosis in cancer cells[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2010，42（5）：623-629.

[8]蘭春慧，房殿春，樊麗琳，等. 線粒體內(nèi)膜蛋白ANT在幽門螺桿菌致胃癌細(xì)胞凋亡中的表達(dá)[J]. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2009，18（2）：100-102.

[9]Zamora M，Granell M，Mampel T，et al. Adenine nucleotide translocase 3（ANT3） overexpression induces apoptosis in cultured cells[J]. FEBS Letters，2004，563（1/2/3）：155-160.

[10]崔秀玉，呂國蔚. 腦缺氧和腦缺氧適應(yīng)時(shí)能量代謝的變化[J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，17（2）：153-155.

[11]李 麗，趙成萍，李 宏，等. 質(zhì)粒制備絕對定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方法的建立[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，19（6）：1157-1162.