基于超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜的稻田環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺殘留量檢測(cè)

陳湘燕，張 盈，秦立新，伍貴方，段婷婷*

(1.貴州省植物保護(hù)研究所，貴州 貴陽(yáng)550006，2.黔南州農(nóng)業(yè)委員會(huì)，貴州 都勻558000)

環(huán)酰菌胺(Fenhexamid)和噻酰菌胺(Tiadinil)是新型酰胺類內(nèi)吸性殺菌劑，主要用于大田作物、蔬菜、果樹(shù)等病害的防治［1－2］，并且對(duì)已產(chǎn)生抗藥性的抗性菌亦有防效，由于二者低毒，無(wú)致畸形，所以使用范圍在逐漸擴(kuò)大。關(guān)于這兩種農(nóng)藥在蔬菜、動(dòng)物源性食品、水果等中的殘留檢測(cè)方法分別有報(bào)道，測(cè)定的主要方法有酶聯(lián)免疫法(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(NPD)、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［3－10］。目前，歐盟制定了環(huán)酰菌胺在水稻中的最大殘留限量(MRL)是0.05 mg/kg;韓國(guó)和日本規(guī)定噻酰菌胺在稻米中的MRL值是1 mg/kg，其他國(guó)家和組織沒(méi)有制定環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺在稻米中的MRL值。在我國(guó)，環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺作為防治水稻稻瘟病的藥劑在推廣使用，但在水稻生態(tài)系統(tǒng)中檢測(cè)這兩種藥劑的殘留分析方法未見(jiàn)報(bào)道。

超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLCMS/MS)測(cè)定，結(jié)合基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)凈化，是一種同時(shí)具備高效率、高特異性和高靈敏度的普適性方法，廣泛用于農(nóng)藥及環(huán)境污染物的殘留分析測(cè)定［11］。本文建立了采用分散固相萃?。璘PLC－MS/MS法同時(shí)測(cè)定稻田生態(tài)系統(tǒng)中環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺殘留分析檢測(cè)方法，為水稻的安全生產(chǎn)以及稻田生態(tài)系統(tǒng)中相應(yīng)的農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)和確證提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

環(huán)酰菌胺(99.5%)標(biāo)準(zhǔn)品，噻酰菌胺(99%)標(biāo)準(zhǔn)品(北京勤誠(chéng)亦信科技開(kāi)發(fā)有限公司);乙腈(色譜純、分析純);水(Milli－Q超純水);N－丙基乙二胺(PSA，Agela Technologies公司);石墨化碳黑(GCB，德國(guó)CNW Technologies GmbH公司);超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC－MS/MS，TSQVantage，Thermo公司);Hypersil GOLD色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9μm，Thermos公司)，HR 1727/06/BC飛利浦粉碎機(jī)(珠海飛利浦家庭電器有限公司);SK－1漩渦混合器(江蘇中大儀器廠);TG16臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司);Filter Unit濾膜(0.22μm，Agela Technologies公司)。

1.2 標(biāo)樣溶液的配制

用電子天平分別準(zhǔn)確稱取環(huán)酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)品(99.5%)0.010 0 g和噻酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)品(99.0%)0.010 1 g(精確到0.000 1 g)，用色譜純乙腈溶解并定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的儲(chǔ)備液，于4℃冰箱中保存。準(zhǔn)確移取適量?jī)?chǔ)備液，分別用色譜純乙腈稀釋成2、1、0.5、0.05、0.005 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3 樣品前處理方法

土壤除去根、雜物，稻谷脫殼，稻米、稻殼和稻稈用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)24 000 r/min打碎，混勻。

1.3.1 提取 稻田土、稻田水:準(zhǔn)確稱取10.0 g樣品于50 mL具塞離心管中;加入10 mL乙腈，渦旋3 min，加入1 g氯化鈉和4 g無(wú)水硫酸鎂，渦旋1 min，以4 000 r/min離心5 min，取上清液待凈化。

稻米、稻殼、稻稈:準(zhǔn)確稱取5.0 g樣品于50 mL具塞離心管中，加入5 mL水，渦旋30 s;加入10 mL乙腈，渦旋3 min，加入1 g氯化鈉和4 g無(wú)水硫酸鎂，渦旋1 min，以4000 r/min離心5 min，取上清液待凈化。

1.3.2 凈化 稻田土、水、稻米:取1.5 mL上清液，加入到盛有150 mg無(wú)水硫酸鎂、50 mg PSA的2 mL離心管中，渦旋1vmin，以5 000 r/min離心5 min，取上清液，過(guò)0.22μm有機(jī)膜，待進(jìn)樣。

稻殼、稻稈:取1.5 mL上清液，加入到盛有150 mg無(wú)水硫酸鎂、50 mg PSA和10 mg GCB的2 mL離心管中，渦旋1 min，以5 000 r/min離心5 min，取上清液，過(guò)0.22μm有機(jī)膜，待進(jìn)樣。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 色譜條件Hypersil GOLD色譜柱;柱溫:40℃;流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為水溶液，二元梯度洗脫:0～0.2 min，20%A;0.2～0.5 min，20%～90%A;0.5～2.8 min，90%A;2.8～3.5 min，90%～60%A，3.5～5.0 min，60%～20%A，5.0～6.0 min，20%A;流速:0.25 mL/min;進(jìn)樣量:2μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件 大氣壓化學(xué)電離ESI－方式掃描方式，毛細(xì)管溫度350℃;電噴霧電壓2 800 V;鞘氣及輔助氣是氮?dú)?，鞘氣流?0 arb，輔助氣流速10 arb;碰撞氣為氬氣。環(huán)酰菌胺S－leans射頻電壓45 V，定性離子對(duì)300.2/249.2，定量離子對(duì)300.2/264.2，碰撞能量分別為33 V和22 V。噻酰菌胺S－leans射頻電壓46 V，定性離子對(duì)266.2/239.2，定量離子對(duì)266.2/71.0，碰撞能量分別為13 V和15 V。

1.5 方法的線性關(guān)系

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effects)是LC/MS進(jìn)行生物樣品測(cè)定時(shí)常常產(chǎn)生的現(xiàn)象?；|(zhì)效應(yīng)影響大時(shí)會(huì)降低方法的靈敏度，影響方法的準(zhǔn)確性［12］。本文對(duì)目標(biāo)化合物中存在的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了研究。分別準(zhǔn)確吸取系列環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(20、10、5、0.5、0.05 mg/kg)100μL，氮吹至干，準(zhǔn)確加入1 mL按1.2.3步驟的各種空白溶液，即得基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。2、1、0.5、0.05、0.005 mg/L的系列溶劑標(biāo)準(zhǔn)品溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.2.4分析條件下進(jìn)樣，以環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以它對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)作圖。經(jīng)最小二乘法擬合得溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和各基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程(表1)。其線性范圍在0.005～2 mg/L之間。

1.6 方法的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度

方法的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度分別用添加回收率、變異系數(shù)和最低檢出量(LOD)與最低定量限(LOQ)衡量。在稻田土、稻田水、稻米、稻殼和稻稈的空白樣品中分別準(zhǔn)確加入環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺的混合標(biāo)準(zhǔn)液，使其分別相當(dāng)于0.005、0.05、0.5、1.0和2.0 mg/kg的添加水平。按照1.3中所述步驟進(jìn)行提取、凈化，1.4條件下測(cè)定，5次重復(fù)，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。LOD以最低添加水平的色譜圖中噪音信號(hào)的三倍計(jì)算，LOQ以最低添加濃度表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)方法的選擇

目前對(duì)于環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺主要方法有酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法。液相色譜法、氣相色譜法的前處理過(guò)程復(fù)雜，多采用液液分配和固相萃取來(lái)凈化，使用的有機(jī)溶劑多，對(duì)環(huán)境造成二次污染。液相色譜法雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，靈敏度低，且屬非選擇性檢測(cè)，遇到復(fù)雜樣品可能出現(xiàn)假陽(yáng)性。氣相色譜法因氣化和高溫易導(dǎo)致農(nóng)藥降解不足，檢出限高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)。酶聯(lián)免疫法主要用于醫(yī)學(xué)和食品檢定。超高效液相色譜－質(zhì)譜/質(zhì)譜法現(xiàn)今已廣泛地應(yīng)用于農(nóng)作物及食品中殘留物質(zhì)的分析檢測(cè)，它操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，選擇性強(qiáng)，定量準(zhǔn)確，線性范圍寬。

2.2 測(cè)試條件優(yōu)化

為了獲得最佳的靈敏度和分離效果，采用直接進(jìn)樣方式，掃描范圍m/z為200～600，選擇合適的離子源和流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在1.4所示的選擇監(jiān)控離子、S－leans射頻電壓及碰撞能量下，電噴霧離子化、負(fù)離子掃描模式可使環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺具有較好的電離效果并獲得特征離子峰［MH］。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步選擇質(zhì)譜參數(shù)，選擇最適的監(jiān)測(cè)離子、S－leans射頻電壓及碰撞能量。采用甲醇和水體系為流動(dòng)相，在1.4.1條件下梯度洗脫，可得到較高的靈敏度、重現(xiàn)性及峰形。

2.3 凈化劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)樣品凈化過(guò)程，主要采用PSA去除基質(zhì)中的干擾雜質(zhì)。但水稻植株和稻殼樣品含有大量色素，僅使用PSA，其凈化效果不佳，因此在PSA凈化基礎(chǔ)上，加入了適量的石墨化碳黑輔助凈化。結(jié)果表明，采用PSA和石墨化碳黑混合凈化劑在處理水稻植株和稻殼樣品，能取得理想的凈化效果。且在獲得較好回收率的同時(shí)，獲得了較好的重現(xiàn)性，簡(jiǎn)化了操作程序，提高了效率。

2.4 方法的線性關(guān)系與靈敏度

采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比(K)來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng):當(dāng)K在0.9～1.1之間時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，當(dāng)K大于1.1時(shí)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，小于0.9則是基質(zhì)減弱效應(yīng)［13］。由表1可知，環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺的稻田土、稻米、稻殼和稻桿基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比(K)小于0.9，屬于基質(zhì)減弱效應(yīng)，而稻田水基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比(K)在0.9和1.1之間，則環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺在稻田水基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)不明顯。為保證方法的通用性和適用性，本文通過(guò)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)樣液校正消除基質(zhì)效應(yīng)影響。

表1 環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺(0.005～2 mg/L)的線性方程、相關(guān)系數(shù)和方法檢測(cè)限Tab.1 The linear equations(0.005～2 mg/L)，correlation coefficients and LOD of fenhexamid and tiadinil

2.5 方法的回收率、精密度

由表2可見(jiàn)經(jīng)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品校正后環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺在稻田土、稻田水、稻米、稻殼和水稻稈中的平均回收率為81.9%～107.6%，變異系數(shù)為1.4%～9.6%，表明本方法有較好的準(zhǔn)確度和精密度可以滿足殘留定量分析的要求。添加色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺在樣品中的總離子流圖(a:噻酰菌胺總離子流圖;b:環(huán)酰菌胺總離子流圖)Fig.1 Total ion Chromatograms of fenhexamid and tiadinil in samples(a:Total ion Chromatograms of tiadinil;b:Total ion Chromatograms of fenhexamid)

表2 煙環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺在水稻中的添加回收率和變異系數(shù)(n=5)Tab.2 Recovery rate and coefficients of variation of fenhexamid and tiadinil in rice(n=5)

3 結(jié)論

本研究建立了采用乙腈提取，PSA和GCB凈化并結(jié)合UPLC－MS/MS快速同時(shí)檢測(cè)環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺在稻田生態(tài)系統(tǒng)中的殘留量。此方法中環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺在0.005～2 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，在0.005～2 mg/kg添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)稻田土、稻田水、稻米、稻殼和水稻稈中的平均回收率為81.9%～107.6%，變異系數(shù)為1.4%～9.6%。該方法的準(zhǔn)確度和靈敏度均符合我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求，且環(huán)保、簡(jiǎn)便快捷，易操作，能夠滿足環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺在稻田生態(tài)系統(tǒng)中殘留量的快速檢測(cè)和確證的要求。

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