miR—26a抑制胃癌AGS細胞生長的分子機制

邵發(fā)保+++徐祝麗+++黃勤蘭

[摘要] 目的 檢測miR-26a在胃癌組織的表達改變，明確miR-26a調(diào)控胃癌細胞生長的分子機制。方法 運用qRT-PCR檢測71例胃癌及相應(yīng)癌旁正常組織中miR-26a的表達改變；將miR-26a 模擬物轉(zhuǎn)染胃癌細胞AGS，采用Western blot檢測其對MTDH蛋白表達水平的影響；然后采用MTT法檢測高表達miR-26a對AGS細胞生長增殖的影響。結(jié)果 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-26a在71例胃癌組織中表達下調(diào)0.44倍；Western blot結(jié)果顯示，過表達miR-26a或干擾MTDH可抑制MTDH蛋白的表達。MTT檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染MTDH siRNA和miR-26a 模擬物組AGS細胞從48 h起OD值分別為（0.158±0.006）、（0.201±0.006），與對照組細胞相比（0.515±0.032）、（0.479±0.028），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 miR-26a通過靶向調(diào)控MTDH的表達而抑制胃癌細胞的生長。

[關(guān)鍵詞] miR-26a；胃癌；生長增殖

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）26-0011-03

miRNAs 調(diào)控重要的生物學(xué)過程，包括發(fā)育、細胞增殖和凋亡、細胞分化、代謝等，并且在很多疾病中表達失調(diào)，包括腫瘤[1，2]。根據(jù)生物軟件的預(yù)測，每個miRNA可能調(diào)控上百個靶基因，大約調(diào)控人類1/3蛋白編碼基因的表達。目前，對miRNA的研究正逐步從基本的腫瘤分子研究走向臨床應(yīng)用領(lǐng)域。miRNAs可作為一個潛在的生物標志物用于胃癌的診斷、預(yù)后、藥物反應(yīng)以及易感性的預(yù)測等方面的潛能。研究表明，miR-26a在肝癌、鼻咽癌、胃癌以及乳腺癌組織和細胞中表達下調(diào)，且抑制腫瘤細胞的生長增殖[3-5]。但miR-26a在胃癌中的具體生物學(xué)功能并不清楚。本研究擬通過采用qRT-PCR、Western blot以及MTT法檢測miR-26a在胃癌中的生物學(xué)作用及作用機制。

1 資料與方法

1.1臨床資料

收集2008年1月～2013年7月間我院收治且確診為胃癌的患者71例。中位年齡53（39～70）歲。病理診斷結(jié)果均經(jīng)兩名以上病理科醫(yī)生確認。

1.2主要材料

miR-26a 模擬物及對照模擬物從Ambion公司購買。MTDH siRNA質(zhì)粒從santa cruz公司購買。MTDH抗體和β-actin抗體購自santa cruz公司。Trizol和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。PRIM1640培養(yǎng)基和胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品。MTS細胞生長增殖/毒性檢測試劑盒購自美國Sigma公司。

1.3 Western blot

將miR-26a模擬物或MTDH siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AGS細胞，48 h后提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。各組取等量樣本，進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%BSA封閉，加入MTDH或GAPDH抗體，4℃過夜。TBST洗膜30 min，加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜30 min，加入ECL發(fā)光劑，X片曝光、顯影、定影。

1.4 MTT法檢測細胞增殖活性

取轉(zhuǎn)染后的AGS細胞，消化后接種細胞于96孔板中，每空5000個細胞，每組設(shè)6個復(fù)孔，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在未接種細胞的孔中加入RPMI-1640培養(yǎng)基中作為調(diào)零孔。接種72 h后，每孔加20 μL MTS檢測試劑，37℃孵育2 h，用酶標儀測定492 nm波長吸光度值（OD492）。實驗重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有結(jié)果均以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌及其相應(yīng)癌旁組織中miR-26a表達水平分析

qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-26a在71例胃癌組織中的表達為（0.49±0.11），在71例胃癌癌旁正常組織中表達為（1.12±0.20），兩者相比下調(diào)0.44倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P =0.008）。

2.2 miR-26a對胃癌AGS細胞中MTDH蛋白表達的影響

研究已表明MTDH是miR-26a的靶基因，為了明確miR-26a對胃癌AGS細胞MTDH的蛋白質(zhì)表達的調(diào)控作用，將miR-26a 模擬物轉(zhuǎn)染胃癌AGS細胞，以轉(zhuǎn)染miR-26a-對照為陰性對照，轉(zhuǎn)染MTDH siRNA為陽性對照，轉(zhuǎn)染48 h后收集蛋白。Western blot檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-26a模擬物組和MTDH siRNA組MTDH蛋白表達水平較陰性對照組明顯降低（圖1）。結(jié)果提示，miR-26a能下調(diào)胃癌AGS細胞系中MTDH蛋白質(zhì)的表達。

2.3 miR-26a對胃癌細胞增殖能力的影響

分別將miR-26a-模擬物，miR-26a-對照（陰性對照組）和MTDH siRNA以及siRNA-對照（陰性對照組）轉(zhuǎn)入AGS細胞24、48、72 h后，通過MTT法檢測其對細胞增殖活性的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染MTDH siRNA和miR-26a 模擬物組AGS細胞從48 h起OD值分別為（0.158±0.006）、（0.201±0.006），其增殖速度明顯減慢，與miR-26a 對照組細胞相比（0.515±0.032）、（0.479±0.028），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示高表達miR-26a通過下調(diào)MTDH的表達，從而抑制胃癌AGS細胞的生長增殖。

3討論

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居第四位，死亡率居第二位[6]。其中，大約60%的胃癌患者發(fā)生在東亞（主要在中國）。在中國，大約2/3的胃癌患者發(fā)展成為晚期或轉(zhuǎn)移性癌癥，超過一半的患者在根治性手術(shù)后復(fù)發(fā)，而這些患者的生存期一般為6～9個月[7]。隨著生活水平的提高、內(nèi)窺鏡的應(yīng)用以及多模式的治療方案的實施，近幾十年來胃癌的發(fā)病率和死亡率有所下降，但是晚期胃癌的死亡率仍然居高不下。鑒于目前的狀況，有效地早期生物標志物的鑒定以及高效低毒藥物的開發(fā)成為當務(wù)之急。

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多步驟、多階段的病理過程，涉及很多相關(guān)癌基因和抑癌基因的變化。盡管目前在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等方面進行了廣泛的研究，但是目前對于胃癌的發(fā)生發(fā)展機制仍然知之甚少。這可能是由于胃癌是一種遺傳異質(zhì)性疾病，通過不同的途徑所致。miRNA表達譜研究表明，其在不同類型的腫瘤中表達水平各異。研究證實，異常的miRNA基因往往位于癌癥相關(guān)的基因突變位點，說明miRNA參與癌癥的發(fā)生發(fā)展。研究表明，不同的miRNA參與胃癌發(fā)展過程中的不同組織學(xué)類型和疾病發(fā)展的不同階段，如miR-105、miR-100、miR-125b、miR-199a、miR-99a、miR-143、miR-145、miR-133a 在彌漫型胃癌中表達上調(diào)，而miR-373*， miR-498， miR-202*， miR-494 在腸型胃癌中表達上調(diào)[8]。在未分化的胃癌組織中， miR-34b、miR-34c、miR-128a 明顯上調(diào)， 而miR-128b、miR-129、miR-148卻表達下調(diào)。目前有關(guān)miR-26a在腫瘤中作用的研究報道很少。研究表明miR-26a在肝癌中下調(diào)，其表達水平與肝癌患者生存時間及對干擾素治療的敏感性相關(guān)[3]。miR-26a在鼻咽癌中表達下調(diào)且能通過靶基因EZH2抑制鼻咽癌細胞生長和致瘤性[4]。同時miR-26a能明顯抑制乳腺癌細胞增殖生長，誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡[9]。進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-26a可通過靶向MTDH抑制乳腺癌細胞的生長增殖[10]。MTDH最初是在胎兒膠質(zhì)細胞瘤中發(fā)現(xiàn)，是一個HIV誘導(dǎo)的基因，并且作為癌基因參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究證實MTDH在多種惡性腫瘤中表達上調(diào)，并且通過PI3K-AKT、NF-κB、MAPK以及Wnt/β-catenin信號途徑參與腫瘤發(fā)生的多種生物學(xué)過程[11]。

綜上所述，miR-26a在胃癌細胞中表達下調(diào)，并通過直接靶向調(diào)控MTDH的表達發(fā)揮生物學(xué)作用，我們將繼續(xù)深入miR-26a在胃癌中的功能和分子研究，系統(tǒng)闡明miR-26a參與胃癌發(fā)生發(fā)展的可能分子機制，為胃癌的治療提供新的治療靶點。

[參考文獻]

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[10] Zhang B，Liu XX，He JR，et al. Pathologically decreased miR-26a antagonizes apoptosis and facilitates carcinogenesis by targeting MTDH and EZH2 in breast cancer[J]. Carcinogenesis，2011，32（1）：2-9.

[11] Butowski NA，Sneed PK，Chang SM. Diagnosis and treatment of recurrent high-grade astrocytoma[J]. J Clin Oncol，2006，24（8）：1273-1280.

（收稿日期：2014-04-24）

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多步驟、多階段的病理過程，涉及很多相關(guān)癌基因和抑癌基因的變化。盡管目前在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等方面進行了廣泛的研究，但是目前對于胃癌的發(fā)生發(fā)展機制仍然知之甚少。這可能是由于胃癌是一種遺傳異質(zhì)性疾病，通過不同的途徑所致。miRNA表達譜研究表明，其在不同類型的腫瘤中表達水平各異。研究證實，異常的miRNA基因往往位于癌癥相關(guān)的基因突變位點，說明miRNA參與癌癥的發(fā)生發(fā)展。研究表明，不同的miRNA參與胃癌發(fā)展過程中的不同組織學(xué)類型和疾病發(fā)展的不同階段，如miR-105、miR-100、miR-125b、miR-199a、miR-99a、miR-143、miR-145、miR-133a 在彌漫型胃癌中表達上調(diào)，而miR-373*， miR-498， miR-202*， miR-494 在腸型胃癌中表達上調(diào)[8]。在未分化的胃癌組織中， miR-34b、miR-34c、miR-128a 明顯上調(diào)， 而miR-128b、miR-129、miR-148卻表達下調(diào)。目前有關(guān)miR-26a在腫瘤中作用的研究報道很少。研究表明miR-26a在肝癌中下調(diào)，其表達水平與肝癌患者生存時間及對干擾素治療的敏感性相關(guān)[3]。miR-26a在鼻咽癌中表達下調(diào)且能通過靶基因EZH2抑制鼻咽癌細胞生長和致瘤性[4]。同時miR-26a能明顯抑制乳腺癌細胞增殖生長，誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡[9]。進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-26a可通過靶向MTDH抑制乳腺癌細胞的生長增殖[10]。MTDH最初是在胎兒膠質(zhì)細胞瘤中發(fā)現(xiàn)，是一個HIV誘導(dǎo)的基因，并且作為癌基因參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究證實MTDH在多種惡性腫瘤中表達上調(diào)，并且通過PI3K-AKT、NF-κB、MAPK以及Wnt/β-catenin信號途徑參與腫瘤發(fā)生的多種生物學(xué)過程[11]。

綜上所述，miR-26a在胃癌細胞中表達下調(diào)，并通過直接靶向調(diào)控MTDH的表達發(fā)揮生物學(xué)作用，我們將繼續(xù)深入miR-26a在胃癌中的功能和分子研究，系統(tǒng)闡明miR-26a參與胃癌發(fā)生發(fā)展的可能分子機制，為胃癌的治療提供新的治療靶點。

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[11] Butowski NA，Sneed PK，Chang SM. Diagnosis and treatment of recurrent high-grade astrocytoma[J]. J Clin Oncol，2006，24（8）：1273-1280.

（收稿日期：2014-04-24）

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多步驟、多階段的病理過程，涉及很多相關(guān)癌基因和抑癌基因的變化。盡管目前在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等方面進行了廣泛的研究，但是目前對于胃癌的發(fā)生發(fā)展機制仍然知之甚少。這可能是由于胃癌是一種遺傳異質(zhì)性疾病，通過不同的途徑所致。miRNA表達譜研究表明，其在不同類型的腫瘤中表達水平各異。研究證實，異常的miRNA基因往往位于癌癥相關(guān)的基因突變位點，說明miRNA參與癌癥的發(fā)生發(fā)展。研究表明，不同的miRNA參與胃癌發(fā)展過程中的不同組織學(xué)類型和疾病發(fā)展的不同階段，如miR-105、miR-100、miR-125b、miR-199a、miR-99a、miR-143、miR-145、miR-133a 在彌漫型胃癌中表達上調(diào)，而miR-373*， miR-498， miR-202*， miR-494 在腸型胃癌中表達上調(diào)[8]。在未分化的胃癌組織中， miR-34b、miR-34c、miR-128a 明顯上調(diào)， 而miR-128b、miR-129、miR-148卻表達下調(diào)。目前有關(guān)miR-26a在腫瘤中作用的研究報道很少。研究表明miR-26a在肝癌中下調(diào)，其表達水平與肝癌患者生存時間及對干擾素治療的敏感性相關(guān)[3]。miR-26a在鼻咽癌中表達下調(diào)且能通過靶基因EZH2抑制鼻咽癌細胞生長和致瘤性[4]。同時miR-26a能明顯抑制乳腺癌細胞增殖生長，誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡[9]。進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-26a可通過靶向MTDH抑制乳腺癌細胞的生長增殖[10]。MTDH最初是在胎兒膠質(zhì)細胞瘤中發(fā)現(xiàn)，是一個HIV誘導(dǎo)的基因，并且作為癌基因參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究證實MTDH在多種惡性腫瘤中表達上調(diào)，并且通過PI3K-AKT、NF-κB、MAPK以及Wnt/β-catenin信號途徑參與腫瘤發(fā)生的多種生物學(xué)過程[11]。

綜上所述，miR-26a在胃癌細胞中表達下調(diào)，并通過直接靶向調(diào)控MTDH的表達發(fā)揮生物學(xué)作用，我們將繼續(xù)深入miR-26a在胃癌中的功能和分子研究，系統(tǒng)闡明miR-26a參與胃癌發(fā)生發(fā)展的可能分子機制，為胃癌的治療提供新的治療靶點。

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[11] Butowski NA，Sneed PK，Chang SM. Diagnosis and treatment of recurrent high-grade astrocytoma[J]. J Clin Oncol，2006，24（8）：1273-1280.

（收稿日期：2014-04-24）