一種建立小鼠2型糖尿病心肌病模型的方法*

王金鑫， 段 鵬， 朱慶磊△

(1解放軍總醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100853； 2解放軍371醫(yī)院心內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

糖尿病是導(dǎo)致糖尿病心肌病的重要原因，糖尿病心肌病嚴(yán)重威脅糖尿病患者的生命健康。自Hayat等[1]首次提出糖尿病心肌病概念以來，國內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了研究，但其中仍有許多未知因素，其防治也未得到根本性改善[2]。因此，我們需要建立糖尿病心肌病的動(dòng)物模型以明確糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制。

當(dāng)前，糖尿病心肌病的動(dòng)物模型有：(1)自發(fā)性模型，如ob/ob小鼠、db/db小鼠、GK大鼠和OLETF大鼠等；(2)誘發(fā)性模型，如單純高糖高脂飲食(high-fat diet，HFD)、一次大劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、多次小劑量腹腔注射STZ和HFD結(jié)合腹腔注射STZ等[3-4]。雖然動(dòng)物模型有多種，但大都存在一些缺點(diǎn)，如自發(fā)性模型的費(fèi)用較高，且此類基因突變的動(dòng)物模型不適宜評(píng)價(jià)藥物療效；單純HFD誘導(dǎo)動(dòng)物模型的造模時(shí)間較長；腹腔注射大劑量STZ造成動(dòng)物死亡率增高；多次小劑量腹腔注射STZ操作較為繁瑣等。而采用HFD結(jié)合腹腔注射STZ建立2型糖尿病心肌病小鼠模型相比而言具有諸多優(yōu)勢(shì)。目前，國內(nèi)外在采用連續(xù)HFD結(jié)合STZ建立2型糖尿病心肌病大鼠模型的研究較多[5-7]，但以此方法制備小鼠模型的文獻(xiàn)則較為罕見。由于小鼠模型存在世代周期短、操作方便和遺傳修飾研究相對(duì)成熟等優(yōu)勢(shì)，所以建立2型糖尿病心肌病小鼠模型有利于深入研究2型糖尿病心肌病。本研究采用連續(xù)HFD結(jié)合單次腹腔注射低劑量STZ的方法，建立小鼠2型糖尿病心肌病模型。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5～6周齡C57BL/6J雄性小鼠，購于解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)為No. 11400700164757。小鼠飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)。室溫保持在20～26 ℃，濕度為0.4～0.7，每天12 h晝夜循環(huán)(光照時(shí)間為7:00 AM～7:00 PM)，自由進(jìn)食水。造模實(shí)驗(yàn)開始前，適用性飼養(yǎng)1周。所有操作均符合解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)的要求。

2 藥品與試劑

高脂飼料購于Research Diets；普通飼料購于北京斯貝福公司；STZ、檸檬酸和檸檬酸鈉均購于Sigma；40 g/L多聚甲醛購于北京索萊寶公司。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1造模方法 將40只小鼠隨機(jī)分成2組：對(duì)照組(control組)和HFD+STZ組，每組各20只小鼠。Control組以普通飼料喂養(yǎng)；HFD+STZ組以高脂飼料喂養(yǎng)4周后，禁食不禁水約12 h，以100 mg/kg的劑量腹腔注射STZ(100 g/L溶于檸檬酸緩沖液)，control組小鼠腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液[8]。密切監(jiān)測(cè)小鼠體重和血糖變化，于第11周和第16周分別選擇control 和HFD+STZ 組小鼠進(jìn)行心功能檢測(cè)、血清胰島素水平檢測(cè)、組織學(xué)觀察和心肌細(xì)胞凋亡分析。

3.2體重(body weight，BW)和血糖測(cè)量 分別于造模實(shí)驗(yàn)開始(0周)、5周、6周、11周和16周，禁食不禁水約12 h后稱重，取鼠尾血用血糖儀測(cè)量空腹血糖值(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)。以空腹血糖值>13.89 mmol/L認(rèn)為2型糖尿病小鼠造模成功[9]。

3.3心功能測(cè)定 用異氟烷吸入麻醉小鼠，固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，使用高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)Vevo 770TM(VisualSonics)檢測(cè)心功能。檢測(cè)指標(biāo)包括二尖瓣E′峰與A′峰之比(ratio of early diastolic peak E′ velocity to late diastolic peak A′ velocity, E′/A′)、二尖瓣E峰與E′峰之比(ratio of mitral valve E velocity to E′ velocity, MV E/E′)、心輸出量(cardiac output, CO)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)以及左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。取3次測(cè)量的平均值。

3.4ELISA檢測(cè) 取小鼠眼球血離心得到血清，用小鼠胰島素檢測(cè)試劑盒(ALPCO)檢測(cè)血清胰島素水平。

3.5組織學(xué)分析 取小鼠心肌組織用40 g/L多聚甲醛溶液固定8～12 h，石蠟包埋，組織切片，蘇木素-伊紅染色。用熒光顯微鏡(Olympus)觀察，分析心肌的病理形態(tài)情況并定量，隨機(jī)選取的小鼠心肌相似截面，并從心肌切片截面上隨機(jī)選取10個(gè)心肌細(xì)胞，計(jì)算其平均值，定量分析心肌細(xì)胞面積。

3.6心肌細(xì)胞凋亡分析 取小鼠心臟組織用40 g/L多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，組織切片，60 ℃孵化15 min，脫蠟，再水化。小鼠心室肌細(xì)胞的凋亡水平使用TUNEL檢測(cè)試劑盒(Roche)檢測(cè)。用熒光顯微鏡觀察，進(jìn)行圖像分析和定量，用Image-Pro Plus軟件在切片截面上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率。

由式(5)可知，代替fal函數(shù)的反雙曲函數(shù)的TD中的參數(shù)有a1、a2、R、b等4個(gè)。這些參數(shù)的整定一般運(yùn)用以往的調(diào)試經(jīng)驗(yàn)試湊法獲得。[7]

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS 17.0。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)或均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。組間多重比較行單因素方差分析后采用 SNK-q檢驗(yàn)或Tamhane’s T2檢驗(yàn)，進(jìn)行各組均數(shù)間兩兩比較；兩獨(dú)立樣本比較選用t-test。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 造模過程中小鼠體重的變化

各組小鼠在造模過程中的體重變化情況顯示，經(jīng)過4周高脂飼料喂養(yǎng)后，HFD+STZ組小鼠相對(duì)于control組體重增加(P<0.05)；注射STZ 1周后HFD+STZ組小鼠體重略有下降，但仍比control組高(P<0.05)；造模第11周和第16周，小鼠體重持續(xù)增加，與control組相比均有顯著差異(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The body weight of mice in the 2 groups. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol group.

圖1各組小鼠體重的比較

2 造模過程中小鼠空腹血糖的變化

在造模過程中小鼠的空腹血糖變化情況示，control組小鼠血糖值較為穩(wěn)定；經(jīng)過4周高脂飼料喂養(yǎng)后，HFD+STZ組小鼠相對(duì)于control組血糖有所增加(P<0.05)，但未達(dá)到13.89 mmol/L，注射STZ 1周后HFD+STZ組血糖顯著增加(>13.89 mmol/L)，造模第11周血糖繼續(xù)增加，第16周血糖較之前比略有下降，但仍高于13.89 mmol/L。造模第6、11和16周小鼠的血糖與同時(shí)期control組相比均有顯著差異(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. Blood glucose of mice in the 2 groups. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol group.

圖2各組小鼠血糖的比較

3 小鼠血清胰島素水平

ELISA檢測(cè)顯示，在造模第11周和16周時(shí)，HFD+STZ組小鼠與同時(shí)期正常對(duì)照組相比血清胰島素水平均降低(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The changes of the serum insulin in the 2 groups. Mean±SEM.n=10.*P<0.05vscontrol group.

圖3小鼠血清胰島素水平的變化

4 小鼠心功能相關(guān)指標(biāo)的變化

于造模第11周和第16周分別選擇control組和HFD+STZ組進(jìn)行心功能檢測(cè)，結(jié)果見表1。造模第11周，HFD+STZ組小鼠與control組相比，E′/A′增大(P<0.05)，其它指標(biāo)變化不明顯；造模第16周，HFD+STZ組小鼠與control組相比，E′/A′和MV E/E′增大(P<0.05)，CO、LVEF和LVFS減小(P<0.05)。

表1小鼠造模后不同時(shí)點(diǎn)心功能相關(guān)指標(biāo)的比較

Table 1. The echocardiographic parameters of mice in the 2 groups at different time points (Mean±SD.n=10)

Variable11thweek16thweekControlHFD+STZControlHFD+STZE′/A′0．92±0．231．35±0．19?1．03±0．021．14±0．11?MVE/E′32．69±1．1033．25±2．7431．82±0．4234．99±3．27?CO(mL/min)37．15±4．5236．79±1．4737．08±1．9732．45±5．35?LVEF(%)54．85±4．0953．62±4．3654．28±1．3850．96±0．22?LVFS(%)31．39±2．6330．43±2．8530．88±0．0227．34±0．10?

*P<0.05vscontrol group.

5 小鼠心肌病理形態(tài)的改變

小鼠心肌組織切片HE染色觀察和定量分析顯示，造模第16周，HFD+STZ組小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)中可見心肌細(xì)胞明顯肥大，心肌細(xì)胞面積明顯大于同時(shí)期control組(P<0.05)；與造模第11周時(shí)control組相比，同時(shí)期HFD+STZ組小鼠心肌細(xì)胞面積變化不明顯，見圖4。

6 小鼠心肌細(xì)胞凋亡分析

小鼠心肌細(xì)胞凋亡分析顯示，在造模第16周時(shí)，HFD+STZ組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯大于同時(shí)期control組(P<0.05)；與造模第11周時(shí)control組相比，同時(shí)期HFD+STZ組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率變化不明顯，見圖5。

Figure 4. HE staining of the heart tissues and cell area quantification in the 2 groups (×400). A: control group (11th week); B: HFD+STZ group (11th week); C: control group (16th week); D: HFD+STZ group (16th week); E: the quantitative analysis of the cell area. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsgroup.

圖4小鼠心臟的HE染色結(jié)果

討 論

2型糖尿病約占所有糖尿病患者的90%以上，并且有證據(jù)顯示60%～75%的血糖控制良好且無其它并發(fā)癥的2型糖尿病患者被證明存在舒張期功能障礙，其中28%發(fā)展為伴左心室充盈壓增高的舒張功能嚴(yán)重受損[10]。隨著糖尿病病人的增多，糖尿病心肌病的防治已成為社會(huì)和醫(yī)學(xué)界共同關(guān)注的問題，但其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。因此，建立2型糖尿病心肌病的動(dòng)物模型并對(duì)其發(fā)病機(jī)制等進(jìn)行研究具有重要意義。

Figure 5. TUNEL analysis of cardiomyocyte apoptosis and apoptosis rate quantification in the 2 groups (×400). A: control group (11th week); B: HFD+STZ group (11th week); C: control group (16th week); D: HFD+STZ group (16th week); E: the quantitative analysis of the apoptotic rate. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group.

圖5小鼠心肌細(xì)胞凋亡的TUNEL分析

2型糖尿病患者隨病程的延長會(huì)出現(xiàn)不同程度的心肌舒縮功能異常，其中左室舒張功能的異常較早出現(xiàn)。臨床上超聲心動(dòng)圖、核素顯像等檢查發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌病患者在出現(xiàn)心功能障礙時(shí)，主要表現(xiàn)為射血分?jǐn)?shù)降低和峰充盈率降低等變化。2型糖尿病患者的代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致廣泛的心肌損害，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、變性、灶性壞死等。鑒于20周齡db/db小鼠出現(xiàn)明顯心臟功能障礙[14]，本研究分別檢測(cè)造模第11周(15周齡)和第16周(20周齡)小鼠的心臟功能。超聲檢測(cè)顯示，在造模第16周時(shí)，HFD+STZ組小鼠與正常對(duì)照組相比E′/A′和MV E/E′增大，心輸出量、左室射血分?jǐn)?shù)和左室短軸縮短率減小，出現(xiàn)心功能障礙。本研究的組織學(xué)和心肌細(xì)胞凋亡分析顯示，在造模第16周時(shí)，HFD+STZ組心肌細(xì)胞肥大，心肌細(xì)胞面積和凋亡率明顯大于同時(shí)期正常對(duì)照組。造模第11周時(shí)2組小鼠上述各項(xiàng)指標(biāo)變化不明顯。本研究的結(jié)果與上述人2型糖尿病心肌病的心功能、心肌細(xì)胞改變相符。

采用連續(xù)HFD結(jié)合單次腹腔注射低劑量STZ的方法建立2型糖尿病心肌病小鼠模型有許多優(yōu)勢(shì)。(1)其相較于單純HFD誘導(dǎo)小鼠模型的造模時(shí)間較短，有研究顯示采用單純HFD飼養(yǎng)大于24周才能復(fù)制出2型糖尿病心肌病小鼠模型[15]。(2)其相較于自發(fā)性2型糖尿病心肌病模型，如db/db小鼠，費(fèi)用更低，并且比此類基因突變的動(dòng)物模型更適宜評(píng)價(jià)藥物療效。(3)有文獻(xiàn)報(bào)道[16]，小鼠腹腔注射150 mg/kg或更大劑量的STZ可使血糖升高更明顯，但這會(huì)造成小鼠死亡率增高，并且這種方法很有可能會(huì)誘導(dǎo)成1型糖尿病心肌病模型;也有一些學(xué)者采用HFD結(jié)合多次注射小劑量STZ的方法建模[17]，STZ溶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配，操作較為繁瑣。本研究給小鼠腹腔單次注射STZ(100 mg/kg)，劑量較為適宜，操作也相對(duì)簡(jiǎn)單，未出現(xiàn)小鼠死亡，造模成功率高。

綜上所述，采用連續(xù)喂養(yǎng)HFD結(jié)合單次注射STZ可成功建立2型糖尿病心肌病小鼠模型，并具有造模周期短、成功率高、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低等優(yōu)勢(shì)，且與人2型糖尿病心肌病臨床特征相符，為深入研究2型糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制、治療藥物等提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ突A(chǔ)。

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