黃芪建中湯對(duì)慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期大鼠mtDNAATPase6、ATPase8基因表達(dá)的影響

魏姍姍　徐升　張念志

摘要：目的探討黃芪建中湯對(duì)慢性阻塞性肺疾病（COPD）穩(wěn)定期大鼠mtDNA ATPase6、ATPase 8基因表達(dá)的影響。方法將120只SD大鼠隨機(jī)分為6組：即A組（正常對(duì)照組）、B組（COPD模型組）、C組（黃芪建中湯高劑量組）、D組（黃芪建中湯中劑量組）、E組（黃芪建中湯低劑量組）、F組（金水寶膠囊組），每組20只。后五組采用氣管內(nèi)注射脂多糖（LPS）加煙熏的方法制作COPD大鼠模型，造模成功后，各治療組分別給藥8周，采用RT-PCR方法檢測(cè)大鼠動(dòng)脈血mtDNA ATPase6、ATPase 8基因表達(dá)變化。結(jié)果A組的熒光生長(zhǎng)曲線呈明顯陽(yáng)性；B組大鼠mtDNA ATPase 6、ATPase 8熒光反應(yīng)較A組明顯下降（P<0.01）；與B組相比：C組、D組、E組、F組熒光反應(yīng)明顯升高（P<0.01），升高的次序?yàn)镃組>D組>F組。C組與D組之間差異顯著（P<0.05），D組與E組之間差異顯著（P<0.05），C組、D組與F組之間差異顯著（P<0.05）。結(jié)論模型組大鼠mtDNA ATPase 6、ATPase 8基因表達(dá)量減少，黃芪建中湯對(duì)mtDNA ATPase 6、ATPase 8的基因表達(dá)有明顯的保護(hù)與恢復(fù)作用，療效優(yōu)于金水寶膠囊組。

關(guān)鍵詞：COPD；黃芪建中湯；mtDNA ATPase6、8

中圖分類號(hào)：R563.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2014）05-0071-03

【Abstract】Objective：To study the effect of Huangqi Jianzhong Decoction（HJD）on mtDNA ATPase 6，ATPase 8 gene expression of chronic obstructive pulmonary（COPD）in stationary phase. Methods：120 SD rats were randomly divided into six groups，Group A（control group），Group B（COPD model group），Group C（HJD high-dose group），Group D（HJD medium-dose group），Group E（HJD medium low-dose group），Group F（Jinshuibao Capsule group），20 rats per group. The latter five groups were given with LPS intratracheal injection plus smoked way to induce COPD rats. Each of the treatment group was administered for 8 weeks. RT-PCR method was used to detect the changes of the mtDNA ATPase 6，ATPase 8 gene expression of arterial blood of the rats. Results：The fluorescence growth curve of Group A was significantly positive，the fluorescence response of the mtDNA ATPase 6、ATPase 8 of Group B was significantly lower than that of Group A（P<0.01）. Compared with Group B，the fluorescence response of Group C，D，E，F(xiàn) was significantly higher（P<0.01），and their increase order was Group C>Group D>Group F. The difference between Group C and D was significant（P<0.05），the difference between Group D and E was significant（P<0.05），the difference between Group C，D and E was significant（P<0.05）. Conclusion：The gene expression of the mtDNA ATPase 6、ATPase 8 of the model rats decrease and Huangqi Jianzhong Decoction could protect and restore the gene expression ans has a better effect than that of Jinshuibao capsule group.

【Key words】COPD，HuangqiJianzhong Decoction，mtDNA ATPase 6 and Pase 8

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）近年來(lái)發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，是世界范圍內(nèi)重要的致殘、致死原因。COPD患者普遍存在免疫力低下、營(yíng)養(yǎng)不良、呼吸肌疲勞等問(wèn)題，單獨(dú)的營(yíng)養(yǎng)支持并不能有效遏制病情的進(jìn)展。COPD穩(wěn)定期主要以鞏固防復(fù)發(fā)，提高人體正氣以防外邪為目的，臨床發(fā)揮中醫(yī)固本治療的特色，采用黃芪建中湯治療COPD穩(wěn)定期患者療效顯著，且優(yōu)于補(bǔ)益肺腎法。本課題以COPD模型大鼠為研究對(duì)象，觀察COPD大鼠mtDNA ATPase6、8基因表達(dá)的改變，從基因與轉(zhuǎn)錄水平來(lái)探討建中補(bǔ)虛法治療COPD的作用機(jī)制。

1研究方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD大鼠，體重（250±10）g，共120只，由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物合格證號(hào)：scxk（皖）2011-002）。動(dòng)物自由飲水和攝食，溫度20℃～23℃，相對(duì)濕度70%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。endprint

1.2藥物與試劑黃芪建中湯（黃芪5 g，白芍20 g，飴糖30 g，桂枝10 g，生姜9 g，炙甘草6 g，大棗6枚）購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，常規(guī)煎法，并濃縮成相應(yīng)濃度。金水寶膠囊由江西金水寶制藥有限公司出品（批準(zhǔn)文號(hào)：（89）衛(wèi)藥準(zhǔn)字z-18號(hào)，批號(hào)：011101）；脂多糖/內(nèi)毒素（美國(guó)Sigma公司，L-2880，10 mg/支）；羅丹明123（Rh123，為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品）；真龍牌香煙（廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司出品，焦油量12 mg，煙氣煙堿量1.2 mg，煙氣一氧化碳量13 mg）；Trizol Reagent（invitrogen公司，貨號(hào)：15596-026）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司，貨號(hào)：00064525）；PCR試劑和Taq DNA聚合酶（Fermentas公司 美國(guó)）；氯仿、無(wú)水乙醇、異丙醇（上海中試化學(xué)試劑有限公司）；DEPC（Sigma公司）；引物及探針合成（invitrogen公司）；熒光定量試劑（TaKaRa公司）。

1.3分組、模型制作及給藥方法將動(dòng)物隨機(jī)分為6組：即A組（正常對(duì)照組）、B組（COPD模型組）、C組（黃芪建中湯組高劑量組）、D組（黃芪建中湯組中劑量組）、E組（黃芪建中湯組低劑量組）、F組（金水寶膠囊組），每組20只。按照宋一平等[1]介紹的方法（香煙霧熏加LPS氣管滴入法）復(fù)制大鼠COPD模型，即制模開(kāi)始后1 d和14 d向氣管內(nèi)滴入LPS各1 g/L，2～13 d和15～60 d每日在80 cm×50 cm×40 cm密閉箱內(nèi)香煙霧熏30 min（烤煙型，焦油量12 mg，煙氣煙堿量1.2 mg），每次10支。黃芪建中湯常規(guī)煎法，并濃縮成相應(yīng)濃度。給藥劑量分別為低劑量組2.8 g/kg/d，中劑量組5.6 g/kg/d，高劑量組11.2 g/kg/d（以上均為生藥量），分別相當(dāng)于臨床用量的5、10、20倍，金水寶膠囊組給藥劑量為0.5 g/kg/d，相當(dāng)于臨床用量的10倍，灌胃8周。

3討論

目前，從脾論治COPD的研究較為活躍，不僅有理論探討、臨床療效觀察，而且還涉及到作用機(jī)理方面的研究，機(jī)理研究方面已涉及到抗炎性介質(zhì)、抗氧化、細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)以及病理學(xué)的改變等內(nèi)容。但綜觀目前的研究現(xiàn)狀，指標(biāo)的相關(guān)性不夠明確，特異性不強(qiáng)，因此中醫(yī)作用機(jī)制及靶點(diǎn)所在尚不明確。眾所周知，線粒體是整個(gè)細(xì)胞乃至生命體進(jìn)行各項(xiàng)生命功能活動(dòng)的樞紐和核心，線粒體作為氧化磷酸化場(chǎng)所，主要功能是合成和利用ATP，為細(xì)胞生命活動(dòng)提供能量。催化此能量偶聯(lián)反應(yīng)的酶為F0F1-ATPase，它位于線粒體內(nèi)膜的基質(zhì)側(cè)，主要由F0和F1組成。ATPase 6、ATPase 8是F0F1-ATPase疏水部分F0的兩個(gè)亞基，由mtDNA ATPase6、ATPase8基因編碼。F0部分是鑲嵌在線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子通道，當(dāng)H+順濃度梯度經(jīng)F0回流時(shí)F1催化ADP和Pi生成并釋放ATP[2]。ATPase6亞基在線粒體電子轉(zhuǎn)遞鏈的氧化磷酸化過(guò)程中起質(zhì)子泵作用，而ATPase8亞基主要與ATP合成酶活性有關(guān)[3～4]。

本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠mtDNA ATPase 6、ATPase 8熒光表達(dá)水平明顯下降，說(shuō)明ATP酶合成減少，線粒體能量代謝障礙；而治療組相較于模型組熒光表達(dá)水平明顯升高，說(shuō)明黃芪建中湯具有對(duì)抗內(nèi)毒素和煙霧造成的ATPase 6、ATPase 8基因表達(dá)下調(diào)，提高ATPase活性，改善細(xì)胞能量供應(yīng)而發(fā)揮其保護(hù)效應(yīng)。

參考文獻(xiàn)：

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)·慢性阻塞性肺疾病診治指南[J]·中華結(jié)核和呼吸雜志，2002，25：453-460.

[2]Ronnemaa T，KnipM，Lautala P，et al.Serum insulin and other cardio 2 vascular risk indicators in children，adolescents and young adults[J].AnnMed，199，l 23（1）：67-72.

[3]MustA，DallalGE，DietzWH.Reference data for obesity：85th and 95th percentiles of body mass index（wt/ht2）and triceps skinfold thickness[J].Am JClinNutr，1991，53（4）：839-846.

[4]BellizziMC，DietzWH.Workshop on childhood obesity：Summary of the discussion[J].Am JClinNutr，1999，70（1）：173-175.

（收稿日期：2014-03-07）endprint

1.2藥物與試劑黃芪建中湯（黃芪5 g，白芍20 g，飴糖30 g，桂枝10 g，生姜9 g，炙甘草6 g，大棗6枚）購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，常規(guī)煎法，并濃縮成相應(yīng)濃度。金水寶膠囊由江西金水寶制藥有限公司出品（批準(zhǔn)文號(hào)：（89）衛(wèi)藥準(zhǔn)字z-18號(hào)，批號(hào)：011101）；脂多糖/內(nèi)毒素（美國(guó)Sigma公司，L-2880，10 mg/支）；羅丹明123（Rh123，為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品）；真龍牌香煙（廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司出品，焦油量12 mg，煙氣煙堿量1.2 mg，煙氣一氧化碳量13 mg）；Trizol Reagent（invitrogen公司，貨號(hào)：15596-026）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司，貨號(hào)：00064525）；PCR試劑和Taq DNA聚合酶（Fermentas公司 美國(guó)）；氯仿、無(wú)水乙醇、異丙醇（上海中試化學(xué)試劑有限公司）；DEPC（Sigma公司）；引物及探針合成（invitrogen公司）；熒光定量試劑（TaKaRa公司）。

1.3分組、模型制作及給藥方法將動(dòng)物隨機(jī)分為6組：即A組（正常對(duì)照組）、B組（COPD模型組）、C組（黃芪建中湯組高劑量組）、D組（黃芪建中湯組中劑量組）、E組（黃芪建中湯組低劑量組）、F組（金水寶膠囊組），每組20只。按照宋一平等[1]介紹的方法（香煙霧熏加LPS氣管滴入法）復(fù)制大鼠COPD模型，即制模開(kāi)始后1 d和14 d向氣管內(nèi)滴入LPS各1 g/L，2～13 d和15～60 d每日在80 cm×50 cm×40 cm密閉箱內(nèi)香煙霧熏30 min（烤煙型，焦油量12 mg，煙氣煙堿量1.2 mg），每次10支。黃芪建中湯常規(guī)煎法，并濃縮成相應(yīng)濃度。給藥劑量分別為低劑量組2.8 g/kg/d，中劑量組5.6 g/kg/d，高劑量組11.2 g/kg/d（以上均為生藥量），分別相當(dāng)于臨床用量的5、10、20倍，金水寶膠囊組給藥劑量為0.5 g/kg/d，相當(dāng)于臨床用量的10倍，灌胃8周。

3討論

目前，從脾論治COPD的研究較為活躍，不僅有理論探討、臨床療效觀察，而且還涉及到作用機(jī)理方面的研究，機(jī)理研究方面已涉及到抗炎性介質(zhì)、抗氧化、細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)以及病理學(xué)的改變等內(nèi)容。但綜觀目前的研究現(xiàn)狀，指標(biāo)的相關(guān)性不夠明確，特異性不強(qiáng)，因此中醫(yī)作用機(jī)制及靶點(diǎn)所在尚不明確。眾所周知，線粒體是整個(gè)細(xì)胞乃至生命體進(jìn)行各項(xiàng)生命功能活動(dòng)的樞紐和核心，線粒體作為氧化磷酸化場(chǎng)所，主要功能是合成和利用ATP，為細(xì)胞生命活動(dòng)提供能量。催化此能量偶聯(lián)反應(yīng)的酶為F0F1-ATPase，它位于線粒體內(nèi)膜的基質(zhì)側(cè)，主要由F0和F1組成。ATPase 6、ATPase 8是F0F1-ATPase疏水部分F0的兩個(gè)亞基，由mtDNA ATPase6、ATPase8基因編碼。F0部分是鑲嵌在線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子通道，當(dāng)H+順濃度梯度經(jīng)F0回流時(shí)F1催化ADP和Pi生成并釋放ATP[2]。ATPase6亞基在線粒體電子轉(zhuǎn)遞鏈的氧化磷酸化過(guò)程中起質(zhì)子泵作用，而ATPase8亞基主要與ATP合成酶活性有關(guān)[3～4]。

本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠mtDNA ATPase 6、ATPase 8熒光表達(dá)水平明顯下降，說(shuō)明ATP酶合成減少，線粒體能量代謝障礙；而治療組相較于模型組熒光表達(dá)水平明顯升高，說(shuō)明黃芪建中湯具有對(duì)抗內(nèi)毒素和煙霧造成的ATPase 6、ATPase 8基因表達(dá)下調(diào)，提高ATPase活性，改善細(xì)胞能量供應(yīng)而發(fā)揮其保護(hù)效應(yīng)。

參考文獻(xiàn)：

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)·慢性阻塞性肺疾病診治指南[J]·中華結(jié)核和呼吸雜志，2002，25：453-460.

[2]Ronnemaa T，KnipM，Lautala P，et al.Serum insulin and other cardio 2 vascular risk indicators in children，adolescents and young adults[J].AnnMed，199，l 23（1）：67-72.

[3]MustA，DallalGE，DietzWH.Reference data for obesity：85th and 95th percentiles of body mass index（wt/ht2）and triceps skinfold thickness[J].Am JClinNutr，1991，53（4）：839-846.

[4]BellizziMC，DietzWH.Workshop on childhood obesity：Summary of the discussion[J].Am JClinNutr，1999，70（1）：173-175.

（收稿日期：2014-03-07）endprint

1.2藥物與試劑黃芪建中湯（黃芪5 g，白芍20 g，飴糖30 g，桂枝10 g，生姜9 g，炙甘草6 g，大棗6枚）購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，常規(guī)煎法，并濃縮成相應(yīng)濃度。金水寶膠囊由江西金水寶制藥有限公司出品（批準(zhǔn)文號(hào)：（89）衛(wèi)藥準(zhǔn)字z-18號(hào)，批號(hào)：011101）；脂多糖/內(nèi)毒素（美國(guó)Sigma公司，L-2880，10 mg/支）；羅丹明123（Rh123，為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品）；真龍牌香煙（廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司出品，焦油量12 mg，煙氣煙堿量1.2 mg，煙氣一氧化碳量13 mg）；Trizol Reagent（invitrogen公司，貨號(hào)：15596-026）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司，貨號(hào)：00064525）；PCR試劑和Taq DNA聚合酶（Fermentas公司 美國(guó)）；氯仿、無(wú)水乙醇、異丙醇（上海中試化學(xué)試劑有限公司）；DEPC（Sigma公司）；引物及探針合成（invitrogen公司）；熒光定量試劑（TaKaRa公司）。

1.3分組、模型制作及給藥方法將動(dòng)物隨機(jī)分為6組：即A組（正常對(duì)照組）、B組（COPD模型組）、C組（黃芪建中湯組高劑量組）、D組（黃芪建中湯組中劑量組）、E組（黃芪建中湯組低劑量組）、F組（金水寶膠囊組），每組20只。按照宋一平等[1]介紹的方法（香煙霧熏加LPS氣管滴入法）復(fù)制大鼠COPD模型，即制模開(kāi)始后1 d和14 d向氣管內(nèi)滴入LPS各1 g/L，2～13 d和15～60 d每日在80 cm×50 cm×40 cm密閉箱內(nèi)香煙霧熏30 min（烤煙型，焦油量12 mg，煙氣煙堿量1.2 mg），每次10支。黃芪建中湯常規(guī)煎法，并濃縮成相應(yīng)濃度。給藥劑量分別為低劑量組2.8 g/kg/d，中劑量組5.6 g/kg/d，高劑量組11.2 g/kg/d（以上均為生藥量），分別相當(dāng)于臨床用量的5、10、20倍，金水寶膠囊組給藥劑量為0.5 g/kg/d，相當(dāng)于臨床用量的10倍，灌胃8周。

3討論

目前，從脾論治COPD的研究較為活躍，不僅有理論探討、臨床療效觀察，而且還涉及到作用機(jī)理方面的研究，機(jī)理研究方面已涉及到抗炎性介質(zhì)、抗氧化、細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)以及病理學(xué)的改變等內(nèi)容。但綜觀目前的研究現(xiàn)狀，指標(biāo)的相關(guān)性不夠明確，特異性不強(qiáng)，因此中醫(yī)作用機(jī)制及靶點(diǎn)所在尚不明確。眾所周知，線粒體是整個(gè)細(xì)胞乃至生命體進(jìn)行各項(xiàng)生命功能活動(dòng)的樞紐和核心，線粒體作為氧化磷酸化場(chǎng)所，主要功能是合成和利用ATP，為細(xì)胞生命活動(dòng)提供能量。催化此能量偶聯(lián)反應(yīng)的酶為F0F1-ATPase，它位于線粒體內(nèi)膜的基質(zhì)側(cè)，主要由F0和F1組成。ATPase 6、ATPase 8是F0F1-ATPase疏水部分F0的兩個(gè)亞基，由mtDNA ATPase6、ATPase8基因編碼。F0部分是鑲嵌在線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子通道，當(dāng)H+順濃度梯度經(jīng)F0回流時(shí)F1催化ADP和Pi生成并釋放ATP[2]。ATPase6亞基在線粒體電子轉(zhuǎn)遞鏈的氧化磷酸化過(guò)程中起質(zhì)子泵作用，而ATPase8亞基主要與ATP合成酶活性有關(guān)[3～4]。

本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠mtDNA ATPase 6、ATPase 8熒光表達(dá)水平明顯下降，說(shuō)明ATP酶合成減少，線粒體能量代謝障礙；而治療組相較于模型組熒光表達(dá)水平明顯升高，說(shuō)明黃芪建中湯具有對(duì)抗內(nèi)毒素和煙霧造成的ATPase 6、ATPase 8基因表達(dá)下調(diào)，提高ATPase活性，改善細(xì)胞能量供應(yīng)而發(fā)揮其保護(hù)效應(yīng)。

參考文獻(xiàn)：

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)·慢性阻塞性肺疾病診治指南[J]·中華結(jié)核和呼吸雜志，2002，25：453-460.

[2]Ronnemaa T，KnipM，Lautala P，et al.Serum insulin and other cardio 2 vascular risk indicators in children，adolescents and young adults[J].AnnMed，199，l 23（1）：67-72.

[3]MustA，DallalGE，DietzWH.Reference data for obesity：85th and 95th percentiles of body mass index（wt/ht2）and triceps skinfold thickness[J].Am JClinNutr，1991，53（4）：839-846.

[4]BellizziMC，DietzWH.Workshop on childhood obesity：Summary of the discussion[J].Am JClinNutr，1999，70（1）：173-175.

（收稿日期：2014-03-07）endprint