超聲波輔助法提取紫蘇葉總黃酮的研究

劉毅君，曾廣燁，李愛(ài)貞

(集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建廈門(mén)361021)

0 引言

紫蘇(Perilla frutescens)是國(guó)家衛(wèi)生部首批頒布的藥食兼用的60種中藥之一［1-2］.紫蘇葉含有蛋白質(zhì)、黃酮類、揮發(fā)油、色素等化學(xué)成分［3］.黃酮類化合物 (flavonoids)，又名生物類黃酮化合物(bioflavonoids)，泛指兩個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)通過(guò)中央三碳鏈相互連結(jié)而成的一系列化合物，分為黃酮類、異黃酮類、查爾酮類、花色素類及黃烷酮類等.黃酮類化合物是一類重要的天然有機(jī)化合物，是植物在長(zhǎng)期自然選擇過(guò)程中產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物，它具有多種生物活性和藥理作用，如防癌抗癌、抗腫瘤、抗心血管疾病、抗骨質(zhì)疏松、消除自由基和抗氧化活性、雌激素樣與抗雌激素樣作用、對(duì)酒精中毒的解毒作用和治療酒依賴的作用等［4-5］.黃酮類化合物的提取方法主要有:有機(jī)溶劑提取法、超聲輔助提取法、微波提取法、超臨界萃取法、酶輔助提取法、堿性水或堿性稀醇提取法等.超聲波輔助提取法利用超聲波機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)加速細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放、擴(kuò)散及溶解，它的提取時(shí)間短、提取溫度低、回收率高、氧化損耗小，在中草藥等天然物質(zhì)有效成分提取中應(yīng)用廣泛［6-10］.本文擬以超聲波輔助乙醇溶液提取紫蘇葉中總黃酮，以期確定最佳提取條件.

1 材料與方法

1.1 材料及預(yù)處理

2013年7—9月采收于集美大學(xué)生物工程學(xué)院自種、無(wú)病蟲(chóng)害的紫蘇葉，洗凈、瀝干，于60℃恒溫干燥箱中烘干，粉碎，40目過(guò)篩，粉末再經(jīng)60℃烘干至恒重，密封于PET瓶中避光保存?zhèn)溆?

1.2 超聲波輔助提取紫蘇葉總黃酮單因素試驗(yàn)

超聲波輔助法提取紫蘇葉總黃酮的工藝流程:紫蘇葉粉末→乙醇浸提，超聲波處理→恒溫水浴浸提→離心→收集上清液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→冷凍干燥→紫蘇葉總黃酮粗提物.

1)提取劑的體積分?jǐn)?shù) 準(zhǔn)確稱取0.500 g紫蘇葉粉末 (以下處理均同)，按1∶30料液比 (g∶mL)，分別加入提取劑20%、30%、40%、50%、60%、70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液，與紫蘇葉粉末混合，浸提.25℃下，對(duì)混合液超聲 (80 kHz、200 W)處理30 min.置于60℃恒溫水浴鍋中浸提1 h，離心，取上清液，用亞硝酸鈉-硝酸鋁分光光度法［9］測(cè)定A500值，試驗(yàn)重復(fù)3次 (下同).

2)料液比 按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 和 1∶60 的料液比 (g∶mL)，將紫蘇葉粉末與體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液混合，浸提.25℃下，對(duì)混合液超聲 (80 kHz、200 W)處理30 min.后續(xù)處理同1).

3)超聲處理時(shí)間 料液比為1∶30，將紫蘇葉粉末與體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液混合，浸提.25℃下，對(duì)混合液分別進(jìn)行超聲處理10、30、50、70、90、110 min.后續(xù)處理同1).

4)水浴浸提溫度 料液比1∶30，將紫蘇葉粉末與50%的乙醇溶液混合，浸提25℃下對(duì)混合液超聲 (80 Hz、200 W)處理30 min，然后分別在40、50、60、70、80、90℃的水浴溫度下浸提1 h，后續(xù)處理同1).

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Tab.1 Orthogonal experiment of four factors at three levels

1.3 超聲波輔助提取紫蘇葉總黃酮正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按照表1的因素水平建立L9(34)正交表，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn).

1.4 紫蘇葉總黃酮含量分析

1.4.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液、紫蘇葉總黃酮粗提液最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確稱取蕓香葉苷·三水標(biāo)準(zhǔn)品至容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶解配制0.500 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液100 mL.取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 mL于10 mL容量瓶中，各用體積分?jǐn)?shù)30% 乙醇溶液補(bǔ)至4 mL，再各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%Na2NO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min.各加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min.再各加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%NaOH溶液2 mL，搖勻，以體積分?jǐn)?shù)30% 乙醇溶液定容至10 mL，搖勻，靜置15 min.以蘆丁含量為0的處理為空白對(duì)照，對(duì)不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液在400～800 nm下掃描測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)，并測(cè)定其吸光度值A(chǔ)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程.用同樣方法測(cè)定紫蘇葉乙醇提取液及其與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液等體積混合液的最大吸收波長(zhǎng).

1.4.2 超聲波輔助法浸提紫蘇葉總黃酮的測(cè)定

按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的處理方法，對(duì)紫蘇葉粉末進(jìn)行處理，準(zhǔn)確吸取2.00 mL樣品上清液于10 mL比色管中，用亞硝酸鈉-硝酸鋁分光光度法，測(cè)定其在吸收波長(zhǎng)下的吸光度值A(chǔ)，根據(jù)回歸方程，計(jì)算紫蘇葉浸提液中的總黃酮含量，單位為mg/g.

1.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取0.500 g紫蘇葉粉末5份，以正交試驗(yàn)得出的最佳提取工藝進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，分別按照1.4.2中的方法進(jìn)行總黃酮含量的測(cè)定.

1.4.4 精密度試驗(yàn)

以正交試驗(yàn)得出的最佳提取工藝進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，然后分別準(zhǔn)確量取2.00 mL待測(cè)液于5個(gè)10 mL比色管中，分別按照1.4.2的方法進(jìn)行總黃酮含量的測(cè)定.

1.4.5 回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已知總黃酮含量的紫蘇葉粉末5份，每份0.500 g，以正交試驗(yàn)得出的最佳提取工藝進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，并分別測(cè)定總黃酮含量.然后分別準(zhǔn)確吸取1.00 mL待測(cè)液于5個(gè)10 mL比色管中，并在每管加入0.20 mL的0.500 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別按照1.4.2的方法進(jìn)行總黃酮含量的測(cè)定，計(jì)算回收率.

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液、紫蘇葉乙醇提取液、標(biāo)準(zhǔn)液和提取液的混合液，其最大吸收波長(zhǎng)均在500 nm處(見(jiàn)圖1)，故選擇500 nm為測(cè)量波長(zhǎng).

以吸光度值A(chǔ)為橫坐標(biāo)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品含量M(mg/mL)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.并得到回歸方程為:Y=11.674 X+0.0173，R2=0.9991.本方程可用于計(jì)算紫蘇葉提取液中總黃酮的含量.

2.2 超聲波輔助提取紫蘇葉總黃酮的單因素試驗(yàn)

結(jié)果表明，在單因素實(shí)驗(yàn)中，以體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液為提取劑時(shí)，其提取效果最好，總黃酮含量達(dá)到18 mg/g(如圖2);料液比為1∶30時(shí)，紫蘇葉的總黃酮得率最高，為16 mg/g(如圖3);超聲處理70 min(如圖4)及70℃水浴提取效果最好 (如圖5).

圖2 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取得率的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoid

圖3 料液比對(duì)總黃酮提取得率的影響Fig.3 The effect of ratio of solid to liquid on the extraction rate of total flavonoid

2.3 超聲波輔助提取紫蘇葉總黃酮工藝條件的正交試驗(yàn)

按表1設(shè)計(jì)的正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，直觀分析圖見(jiàn)圖6.由表2及圖6可知，提取紫蘇葉總黃酮最佳工藝條件為A1B3C3D3，即:乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，料液比1∶40，超聲時(shí)間70 min，水浴溫度80℃.各個(gè)因素對(duì)紫蘇葉總黃酮提取效果的影響程度依次為:D(水浴溫度)＞C(超聲時(shí)間)＞A(乙醇濃度)＞B(料液比).采用極差法分析并進(jìn)行差異顯著性測(cè)定，結(jié)果表明:水浴溫度對(duì)紫蘇葉總黃酮提取效果的影響達(dá)到顯著水平.

圖4 超聲處理時(shí)間對(duì)總黃酮提取得率的影響Fig.4 The effect of ultrasonic processing time on the extraction rate of total flavonoid

圖5 水浴溫度對(duì)總黃酮提取得率的影響Fig.5 The effect of bath temperature on the extraction rate of total flavonoid

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The orthogonal experiment results

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照選定的條件A1B3C3D3進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3.總黃酮提取率均高于正交試驗(yàn)表中的任何一組，且試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好.表明超聲波輔助提取紫蘇葉總黃酮工藝可靠，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小、工藝穩(wěn)定可行.

圖6 直觀分析圖Fig.6 Intuitive analysis diagram of the orthogonal experiment results

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The results of verification experiments

2.5 精密度試驗(yàn)

5次平行測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)偏差為1.03%，表明用分光光度法測(cè)定紫蘇葉中總黃酮含量，精密度較高，所得數(shù)據(jù)精確.

2.6 回收率試驗(yàn)

平均回收率為95.97%，RSD=0.88%(n=5).說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度好、結(jié)果可靠，用此工藝提取紫蘇葉總黃酮是可取的.

2.7 浸提次數(shù)對(duì)總黃酮提取得率的影響

在正交試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)紫蘇葉分別提取 1、2、3、4次，提取率分別為20.43、21.59、21.87、21.95 mg/g，隨著提取次數(shù)的增加，黃酮得率增加，超過(guò)2次后提取率變化不大.因此，從節(jié)約成本及提高提取效率的角度考慮，以提取2次為宜.

3 結(jié)論

以紫蘇葉為材料，總黃酮 (以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品作參比)提取率為指標(biāo)，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，得到影響紫蘇葉總黃酮提取率程度大小依次為:水浴溫度＞超聲波處理時(shí)間＞乙醇濃度＞料液比.極差分析表明:水浴溫度對(duì)紫蘇葉黃酮提取率有顯著影響.超聲波輔助提取紫蘇葉總黃酮的最佳提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)30%，料液比1∶40，超聲波 (80 Hz、200 W)處理時(shí)間70 min，水浴溫度80℃.在此條件下，提取2次，總黃酮提取率達(dá)21.81 mg/g.

對(duì)正交試驗(yàn)選定的條件進(jìn)行驗(yàn)證，表明本文所述方法提取的總黃酮結(jié)果穩(wěn)定，試驗(yàn)重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠.精密度試驗(yàn)及加標(biāo)回收試驗(yàn)法測(cè)得的結(jié)果表明，用紫外分光光度法測(cè)定紫蘇葉中總黃酮含量的準(zhǔn)確度高.因此，用此工藝提取紫蘇葉總黃酮是可取的，適合用紫外分光光度法測(cè)定總黃酮的含量.

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