氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定豬可食性組織中3種β-興奮劑殘留的基質(zhì)效應(yīng)

卞 愧，林 濤，劉 敏，楊建文，王宗楠，賀利民*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)藥理毒理研究室，廣東 廣州 510642；2.東莞出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，廣東 東莞 523000）

β-興奮劑主要用于防治人、獸支氣管哮喘及痙攣［1］，由于其可提高動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉率，常被非法用作飼料添加劑。但長(zhǎng)期使用或?yàn)E用β-興奮劑會(huì)造成其在可食性動(dòng)物組織中殘留，人食用后會(huì)引起肌肉震顫、心悸和過(guò)敏等急性中毒，世界上大多數(shù)國(guó)家已禁止其作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑應(yīng)用于食品動(dòng)物生產(chǎn)［2］。建立科學(xué)、可靠的β-興奮劑殘留分析檢測(cè)方法具有重要意義。

基質(zhì)效應(yīng)(matrix effects，ME)一般指試樣中的非待測(cè)組分影響待測(cè)物濃度或質(zhì)量測(cè)定的準(zhǔn)確度、引起待測(cè)物響應(yīng)值增加或減少的現(xiàn)象［3-5］。隨著植物源基質(zhì)中農(nóng)藥殘留測(cè)定中基質(zhì)效應(yīng)現(xiàn)象研究的深入和措施的有效實(shí)施［6-8］，動(dòng)物源基質(zhì)中獸藥殘留測(cè)定中的基質(zhì)效應(yīng)現(xiàn)象已引起國(guó)內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注，已有分別從樣品提?。?］、液液萃?。?0］和固相萃取凈化［11］、同位素標(biāo)記［12，13］及去除基質(zhì)中的磷脂［14］等方面進(jìn)行的考察，在減少和補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)的措施方法上都取得了較大的進(jìn)展，但這些研究大都是探討液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下的基質(zhì)效應(yīng)現(xiàn)象，涉及β-興奮劑殘留測(cè)定中的基質(zhì)效應(yīng)研究相對(duì)較少［15-17］。為此，本研究在已有 β-興奮劑殘留分析檢測(cè)方法基礎(chǔ)上［18］，探討氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定豬肝和肌肉組織中克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺等β-興奮劑殘留的基質(zhì)效應(yīng)，研究不同狀態(tài)(新鮮與凍干粉)及不同重量的豬組織試樣產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)差異，為有效消除或補(bǔ)償β-興奮劑殘留測(cè)定中的基質(zhì)效應(yīng)提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GCMS-QP2010(日本島津公司)；IKA高速組織勻漿機(jī)(德國(guó) IKA公司)；凍干機(jī)(德國(guó)Christ公司)；純水機(jī)(德國(guó)Millipore公司)。

萊克多巴胺對(duì)照品(含量≥98.5%)、克倫特羅對(duì)照品(含量≥98.5%)、沙丁胺醇對(duì)照品(含量≥98.5%)均購(gòu)自德國(guó) Dr.Ehrenstorfer公司；N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷(99+1，v/v)(Sylon BFT)衍生劑(美國(guó) Sigma-Aldrich公司)；甲苯(色譜純)(美國(guó)Fisher公司)；乙腈等其他試劑均為分析純(廣州化學(xué)試劑廠)。

β-興奮劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 mg/L):分別準(zhǔn)確稱(chēng)取克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺對(duì)照品10 mg，用甲醇溶解，定容至100 mL，-20℃避光保存。

β-興奮劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作液:取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋配制成3種 β-興奮劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 樣品處理

1.2.1 豬組織凍干粉的制備

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1、2、4、5及10 g豬肉和豬肝組織勻漿于西林瓶中(西林瓶先恒重，稱(chēng)量)，于-80℃冰箱冷凍12 h，轉(zhuǎn)到冷凍干燥機(jī)上于-80℃真空冷凍24 h，再次稱(chēng)重后待提取。

1.2.2 豬組織鮮樣和凍干粉的前處理

西林瓶中的豬組織凍干粉用15 mL乙腈和1 mL 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的碳酸鈉溶液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，渦旋，超聲5 min，振蕩20 min，于4℃下以8000 r/min離心10 min。分取1 mL上清液于有塞玻璃試管中，50℃水浴氮?dú)獯蹈?。同時(shí)，稱(chēng)取與凍干組織相應(yīng)重量的各鮮樣同步處理。

將吹干的樣品試管置于80℃烘箱中干燥5 min，取出分別加入100 μL 甲苯和100 μL BFT 衍生劑，渦旋混合30 s，放入烘箱衍生1 h；取出冷卻后用甲苯定容至500 μL，渦旋混合，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱:毛細(xì)管柱HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度:250℃；爐溫程序:初始溫度70℃，保持1 min，然后以35℃/min升至220℃，保持1 min，以35℃/min升至280℃，再以10℃/min升至290℃，保持4 min；載氣:高純氦氣；柱流速0.8 mL/min，不分流進(jìn)樣。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊離子(EI)源:源溫230℃；電子能量:70 eV；接口溫度:290℃。選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)方式，克倫特羅特征離子:m/z 86(定量離子)、212、262、277；沙丁胺醇特征離子:m/z 86、350、369(定量離子)、440；萊克多巴胺特征離子:m/z 179、234、250(定量離子)、502。

1.4 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)方法

按照Matuszewski等［12］提出的提取后添加法定量評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)度。分別測(cè)定空白提取液與純?nèi)軇┲刑砑油瑵舛确治鑫锏碾x子響應(yīng)強(qiáng)度，計(jì)算二者的相對(duì)比值來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行多因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件優(yōu)化

參考農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-3-2008標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)［19］優(yōu)化儀器條件，實(shí)驗(yàn)表明，使用 HP-5MS毛細(xì)管色譜柱在優(yōu)化的色譜條件下目標(biāo)分析物具有良好的色譜行為，可與雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)有效分離。采用全掃描模式獲得3種β-興奮劑藥物的三甲基硅醚衍生物的質(zhì)譜圖如圖1所示，據(jù)此選擇每種分析物靈敏度相對(duì)較高和穩(wěn)定的4個(gè)碎片離子進(jìn)行定性、定量分析。

圖1 3種分析物的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of the three β-agonist drugs

2.2 豬組織凍干粉的相對(duì)重量

根據(jù)不同稱(chēng)樣量時(shí)豬組織試樣凍干前后的重量計(jì)算豬肝臟和肌肉凍干粉占相應(yīng)鮮肝臟和肌肉的相對(duì)重量分別為30.8%～35.0%和28.2%～30.0%，如圖2所示。

2.3 鮮豬肝臟與其凍干粉的基質(zhì)效應(yīng)比較

圖2 豬肝臟和肌肉凍干粉占相應(yīng)鮮組織的相對(duì)重量(n=3)Fig.2 Relative weight of freeze-dried pig liver and muscle to their corresponding fresh samples(n=3)

采用1.2節(jié)前處理方法和1.3節(jié)儀器條件檢測(cè)，3種β-興奮劑呈現(xiàn)顯著的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)?？疾熵i肝臟基質(zhì)狀態(tài)和基質(zhì)重量2個(gè)因素對(duì)3種分析物ME的影響。SPSS多因素方差分析表明，樣品狀態(tài)(鮮樣和凍干粉)對(duì)3種分析物ME的影響差異不顯著(P＞0.05)；基質(zhì)重量對(duì)3種分析物響應(yīng)的影響差異均顯著(P＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 豬肝狀態(tài)及重量對(duì)3種分析物基質(zhì)效應(yīng)的影響Table 1 Influence of pig liver state and its weight on matrix effects of the three analytes

進(jìn)一步分析基質(zhì)狀態(tài)(鮮豬肝及其凍干粉)對(duì)ME的影響。鮮肝臟中克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺的ME分別為179%、317%及1076%，肝臟凍干粉中克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺的ME分別為178%、312%及1081%，二者間各藥物的基質(zhì)效應(yīng)差異均不顯著(P＞0.05)。由于在凍干的過(guò)程中，只是失去了動(dòng)物組織中的水，其他成分沒(méi)有變化，在本研究?jī)?yōu)化的前處理方法條件下，鮮樣與其相應(yīng)凍干粉的基質(zhì)提取成分類(lèi)似，所以目標(biāo)分析物的基質(zhì)效應(yīng)無(wú)顯著差異。

采用GC-MS分析3種藥物存在高的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，特別是基質(zhì)中萊克多巴胺的響應(yīng)是純?nèi)軇┲械?0倍以上，使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)校正尤為重要。鮮豬肝及其相應(yīng)凍干粉中3種β-興奮劑的典型選擇離子色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 純?nèi)軇┡c豬肝組織試樣添加3種β-興奮劑的選擇離子色譜圖Fig.3 Typical ion chromatograms of the three β-agonists in pure solvent and the spiked pig liver samples

鮮豬肝與其凍干粉的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，試樣中水分對(duì)3種β-興奮劑ME的影響較小，豬肝凍干粉的基質(zhì)效應(yīng)與相應(yīng)豬肝臟新鮮組織產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)相當(dāng)。在實(shí)際樣品中β-興奮劑殘留分析測(cè)定時(shí)，可以考慮用處理好的凍干粉萃取物來(lái)配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，以提高殘留分析的科學(xué)性和準(zhǔn)確性，凍干粉與鮮樣匹配重量可以參考圖2結(jié)果。同時(shí)，單因素方差分析表明，1 g和2 g豬肝樣品中克倫特羅的ME與其他實(shí)驗(yàn)豬肝重量樣品間的ME差異顯著(P＜0.05)，沙丁胺醇的ME只有4 g與5 g樣品間的ME差異不顯著(P＞0.05)，其他樣品間差異顯著(P＜0.05)；不同豬肝重量間萊克多巴胺的ME差異均顯著(P＜0.05)。這表明試樣重量對(duì)不同化合物的基質(zhì)效應(yīng)的影響是不同的。隨著試樣基質(zhì)重量增加，其干物質(zhì)的量也相應(yīng)增加，干物質(zhì)中含有的基質(zhì)效應(yīng)物質(zhì)也隨之增加，從而導(dǎo)致ME在一定范圍內(nèi)隨重量增加而增強(qiáng)；當(dāng)樣品重量增加到一定程度時(shí)，可能是一定量的提取液可以提取出來(lái)的基質(zhì)效應(yīng)物質(zhì)的量達(dá)最大，所以ME不再繼續(xù)增強(qiáng)。因此，在一定條件下，稱(chēng)取合適重量的樣品進(jìn)行殘留分析也是值得考慮的。不同重量豬肝中3種β-興奮劑的ME大小見(jiàn)圖4。

圖4 樣品重量對(duì)豬肝臟與肌肉組織中3種β-興奮劑的基質(zhì)效應(yīng)影響(n=3)Fig.4 Influence of sample weight on matrix effects of the three β-agonists in pig liver and muscle tissues(n=3)

2.4 鮮豬肉與其凍干粉的基質(zhì)效應(yīng)比較

多因素方差分析表明，豬肉基質(zhì)狀態(tài)和基質(zhì)重量對(duì)3種分析物ME的影響與豬肝中類(lèi)似，豬肉樣品狀態(tài)(鮮樣和凍干粉)對(duì)3種分析物的ME的影響差異不顯著(P＞0.05)，豬肉重量對(duì)3種分析物的ME影響顯著(P＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 豬肉狀態(tài)及重量對(duì)3種分析物基質(zhì)效應(yīng)的影響Table 2 Influence of state of pig muscle and its weight on matrix effects of the three analytes

依據(jù)上述ME的計(jì)算方法，鮮豬肉中克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺的ME分別為244%、295%及918%，豬肉凍干粉中克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺的ME分別為262%、301%及920%。單因素方差分析表明，鮮豬肉及其凍干粉中3種β-興奮劑的ME與豬肝中的分析結(jié)果類(lèi)似，二者M(jìn)E差異不顯著(P＞0.05)，進(jìn)一步說(shuō)明因鮮豬組織與其相應(yīng)凍干粉的基質(zhì)提取成分類(lèi)似，所以目標(biāo)分析物的基質(zhì)效應(yīng)無(wú)顯著差異。鮮豬肉及其相應(yīng)凍干粉中3種β-興奮劑的典型選擇離子色譜圖見(jiàn)圖5。

進(jìn)一步比較不同重量豬肉的ME，克倫特羅的ME 為5 g＞10 g＞4 g＞2 g＞1 g，1 g樣品與4 g、5 g及10 g樣品，2 g樣品與5 g樣品的ME差異顯著(P＜0.05)；沙丁胺醇的ME為5 g＞10 g＞4 g＞2 g＞1 g，只有5 g與10 g樣品的 ME差異不顯著(P＞0.05)，其他樣品差異顯著(P＜0.05)；萊克多巴胺的ME為5 g＞4 g＞10 g＞2 g＞1 g，只有4 g與10 g樣品的ME差異不顯著(P＞0.05)，其他重量樣品的ME差異顯著(P＜0.05)。單因素方差分析表明，在一定的重量范圍內(nèi)(1～5 g)，與豬肝組織類(lèi)似，ME隨著樣品重量增大而增強(qiáng)；但為什么當(dāng)樣品重量大于5 g時(shí)，豬肉組織中3種分析物的ME均隨樣品重量增加而減小，是否是提取不完全還需深入實(shí)驗(yàn)研究。不同重量豬肉中3種β-興奮劑的ME見(jiàn)圖4。

3 結(jié)論

圖5 純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)與豬肉組織試樣添加3種β-興奮劑的選擇離子色譜圖Fig.5 Typical ion chromatograms of the three β-agonists in pure solvent and the spiked pig muscle samples

本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)評(píng)價(jià)了GC-MS檢測(cè)模式下，不同基質(zhì)重量、不同基質(zhì)狀態(tài)(鮮樣和凍干粉)的豬肝臟和肌肉組織中克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺等3種β-興奮劑的基質(zhì)效應(yīng)。方差分析結(jié)果表明:不同基質(zhì)重量的基質(zhì)效應(yīng)差異顯著(P＜0.05)，不同基質(zhì)狀態(tài)豬肝臟和肌肉組織的鮮樣及其凍干粉的基質(zhì)效應(yīng)差異不顯著(P＞0.05)。豬可食性組織相應(yīng)凍干粉有望作為通用基質(zhì)，用于GC-MS測(cè)定β-興奮劑殘留中基質(zhì)效應(yīng)的校正，也為動(dòng)物性食品中藥物殘留檢測(cè)的基質(zhì)效應(yīng)研究提供理論基礎(chǔ)。

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