高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定遼東楤木不同部位中5種皂苷類成分的含量

馬 慧，宋少江，劉菲菲，張 艷，彭 纓＊

（1.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；2.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

遼東楤木Aralia elata （Miq.）Seem.，五加科（Araliaceae）楤木屬（Aralia）植物，其干燥根皮及莖皮味辛、平，有小毒，具有補(bǔ)氣安神，強(qiáng)精滋腎，祛風(fēng)除濕，活血止痛，健胃利水之功效［1］。國內(nèi)外對其藥理作用研究表明:三萜皂苷類成分是楤木發(fā)揮藥理作用的主要成分，并且具有明顯的抗腫瘤活性和提高免疫功能的作用［2-4］。據(jù)文獻(xiàn)［5-8］報道，目前僅有楤木中單個皂苷（如楤木皂苷A、楤木皂苷C、楤木皂苷Ⅴ、楤木皂苷Ⅵ和楤木皂苷Ⅹ）或總皂苷的測定方法，多采用高效液相色譜-紫外檢測法（HPLCUV）和高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測法（HPLCELSD）。但遼東楤木的化學(xué)成分復(fù)雜，主要有效成分為五環(huán)三萜皂苷類，不具有紫外吸收，而且HPLC-ELSD靈敏度低，故采用HPLC-UV和HPLC-ELSD均不能達(dá)到同時測定多種微量化學(xué)成分的目的。HPLC-MS／MS可以很好地彌補(bǔ)HPLCUV 和 HPLC-ELSD 的不足之處［9，10］，不僅能夠提供充足的結(jié)構(gòu)確證信息，而且由于其較高的靈敏度和專屬性，不需要達(dá)到色譜峰的完全分離即可同時準(zhǔn)確定量多個化合物，因此在中藥質(zhì)量控制方面受到越來越多的關(guān)注［11-13］。

楤木皂苷Ⅱ、楤木皂苷Ⅳ、楤木皂苷Ⅴ、楤木皂苷Ⅹ和楤木葉皂苷Ⅱ?yàn)檫|東楤木中含量較高的成分，且為遼東楤木葉、種子、芽和根皮中的共有成分，同時這5種皂苷具有明顯的藥理活性，故本文建立了同時測定楤木皂苷Ⅱ、楤木皂苷Ⅳ、楤木皂苷Ⅴ、楤木皂苷Ⅹ和楤木葉皂苷Ⅱ在楤木藥材不同部位中含量的HPLC-MS／MS方法，并考察了藥材不同部位之間各皂苷含量的差異，為更合理的開發(fā)使用楤木藥材提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

API 4000 Q TRAP三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配備ESI源和Analyst 1.6數(shù)據(jù)采集軟件）及Eksigent ultraLC100液相色譜系統(tǒng)（美國Applied Biosystem／MDS SCIEX公司）。

楤木皂苷Ⅱ、楤木皂苷Ⅳ、楤木皂苷Ⅴ、楤木皂苷Ⅹ和楤木葉皂苷Ⅱ?qū)φ掌酚缮蜿査幙拼髮W(xué)中藥學(xué)院宋少江教授提供，峰面積歸一化法測定其質(zhì)量純度大于98%，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。楤木葉、楤木根皮、楤木芽和楤木種子藥材采自遼寧省鐵嶺市，經(jīng)沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院宋少江教授鑒別為五加科（Araliaceae）楤木屬（Aralia）植物的干燥葉、根皮、芽和種子。

乙醇（色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司），乙腈（色譜純，美國Sigma公司），甲酸（色譜純，美國Dikma公司），水（天津娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

1.2 溶液配制

對照品儲備液:精密稱取對照品楤木皂苷Ⅱ3.4 mg、楤木皂苷Ⅴ3.0 mg、楤木皂苷Ⅳ2.6 mg、楤木皂苷Ⅹ3.0 mg和楤木葉皂苷Ⅱ3.2 mg，分別置于5 mL容量瓶中，用70%（v／v，下同）甲醇水溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液。分別精密量取上述對照品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用70%甲醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，得楤木皂苷Ⅱ0.0680 g／L、楤木皂苷Ⅴ0.0600 g／L、楤木皂苷Ⅳ0.0520 g／L、楤木皂苷Ⅹ0.0600 g／L、楤木葉皂苷Ⅱ0.0640 g／L的混合對照品儲備液。

供試樣品溶液:取不同楤木藥材0.1 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加入70%乙醇溶液100 mL，稱定，超聲提取60 min，放冷，稱定，70%乙醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液。

1.3 色譜條件

色譜柱為 Alltima C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。流動相A為0.1%的甲酸水溶液，流動相B為乙腈。梯度洗脫程序?yàn)?0～3 min，25%B～30%B；3～18 min，30%B～60%B；18～20 min，60%B～25%B。流速為0.8 mL／min，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為10μL。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源為ESI源；正離子檢測方式；源噴霧電壓為4.5 kV；離子化溫度為650℃；霧化氣（GAS1）為0.34 Pa；輔助加熱氣（GAS2）為0.34 Pa；氣簾氣（CUR）為0.07 Pa。離子采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式，5種目標(biāo)組分的其他質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 5種化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS／MS parameters of the five compounds

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖1 （a）楤木皂苷Ⅱ、（b）楤木皂苷Ⅳ、（c）楤木皂苷Ⅴ、（d）楤木皂苷Ⅹ、（e）楤木葉皂苷Ⅱ的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of（a）congmunosideⅡ，（b）congmunosideⅣ，（c）congmunosideⅤ，（d）congmunosideⅩand（e）congmuyenosideⅡ

分別對比了正離子和負(fù)離子檢測模式。發(fā)現(xiàn)在負(fù)離子模式下，母離子響應(yīng)較低，且碎片離子的穩(wěn)定性較差，其原因可能是由于在負(fù)離子模式下離子化程度低；加入甲酸、醋酸銨、氨水后未得到明顯改善。而采用正離子模式，［M＋Na］＋峰響應(yīng)較好，碎片離子穩(wěn)定，且加入甲酸后響應(yīng)強(qiáng)度更高。因此采用正離子MRM檢測模式，以不同的碰撞能量打碎待測物的準(zhǔn)分子離子，以子離子響應(yīng)最強(qiáng)時的參數(shù)來確定碰撞能量。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

對常用流動相甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.2%甲酸水溶液進(jìn)行了考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用乙腈-0.1%甲酸水溶液作流動相時靈敏度較高，色譜峰形較好。流動相中不添加甲酸時，色譜峰形較差，色譜峰出現(xiàn)分叉現(xiàn)象，可能是離子化程度較低；加入甲酸使離子化程度大大提高，峰形明顯改善；但是加入0.2%的甲酸時，靈敏度稍有下降，說明流動相中甲酸的含量對質(zhì)譜的響應(yīng)也有影響。最終確定采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫。待測組分的色譜圖見圖2。

2.3 線性關(guān)系及檢出限

取各對照品儲備液適量，精確配制不同質(zhì)量濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于優(yōu)化后的條件下分別進(jìn)樣測定。以各物質(zhì)特征碎片離子（定量離子）的峰面積（y）對被測組分的質(zhì)量濃度（x，μg／L）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r2）和線性范圍；以信噪比（S／N）為3確定5種待測組分的檢出限；結(jié)果見表2。

圖2 對照品溶液和供試品溶液的LC-MS／MS色譜圖Fig.2 LC-MS／MS chromatograms of the reference solution and sample solution

表2 5種組分的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限Table 2 Calibration equations，correlation coefficients（r2），linear ranges and detection limits of the five compounds

2.4 精密度和穩(wěn)定性

精密吸取1.2節(jié)的對照品儲備液適量，制成合適濃度的混合對照品溶液，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10μL，測定峰面積。結(jié)果表明楤木皂苷Ⅱ、楤木皂苷Ⅳ、楤木皂苷Ⅴ、楤木皂苷Ⅹ和楤木葉皂苷Ⅱ峰面積的RSD分別為2.0%、2.5%、2.7%、2.4%和2.5%，均符合要求。

取楤木葉干燥粉末，按照1.2節(jié)方法制成供試品溶液。分別在制備好的0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，按1.3節(jié)的色譜條件測定峰面積。結(jié)果楤木皂苷Ⅱ、楤木皂苷Ⅳ、楤木皂苷Ⅴ、楤木皂苷Ⅹ和楤木葉皂苷Ⅱ 的 RSD 分 別 為 1.5%、1.7%、1.6%、0.9% 和1.5%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率

精密稱取已知這5種皂苷成分含量的楤木葉粉末6份，每份0.1 g，精密加入適量的對照品溶液，按照1.2節(jié)方法制成供試品溶液，按優(yōu)化后的條件測定，結(jié)果均符合要求（見表3）。

表3 楤木葉中5種三萜皂苷成分的加標(biāo)回收率（n＝6）Table 3 Spiked recoveries of the five triterpenoid saponins in the leaves of Aralia elata（n＝6）

2.6 樣品測定

取不同部位的楤木適量，按1.2節(jié)供試品制備方法操作，按優(yōu)化后的條件測定峰面積并計算含量，結(jié)果見表4。

表4 楤木不同部位中的5種三萜皂苷類成分的含量（n＝3）Table 4 Contents of the five triterpenoid saponins in different parts of Aralia elata（n＝3）

測定結(jié)果表明，上述5種皂苷總含量的多少順序?yàn)楦ぃ救~＞種子＞芽，證明楤木根皮作為藥用部位具有一定的合理性。楤木葉中被測5種皂苷的量也較高，提示楤木葉中也含有大量的皂苷，而楤木芽及楤木種子中5種皂苷含量相對較低。這一結(jié)果可以為對楤木中的皂苷進(jìn)一步研究以及藥材部位的選擇提供參考。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定楤木皂苷Ⅱ、楤木皂苷Ⅴ、楤木皂苷Ⅳ、楤木皂苷Ⅹ和楤木葉皂苷Ⅱ含量的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法具有簡便、快捷、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)，可用于測定遼東楤木藥材不同部位中的皂苷類成分的含量，進(jìn)而為楤木藥材的質(zhì)量控制和藥物療效、藥代動力學(xué)等相關(guān)研究提供新的參考。

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