同位素稀釋?zhuān)瓪庀嗌V－質(zhì)譜法檢測(cè)大鼠血漿中的內(nèi)源性胍丁胺

丘忠麗， 林 纓， 熊志立， 謝劍煒＊

（1.抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京100850；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110016）

胍丁胺（agmatine，Agm）是精氨酸在細(xì)胞線粒 體膜上左旋精氨酸脫羧酶（L－arginine decarboxy－lase，L－ADC）催化作用下的脫羧產(chǎn)物。1994年Li等［1］首次從哺乳動(dòng)物體內(nèi)成功分離檢測(cè)到胍丁胺。內(nèi)源性胍丁胺及其相應(yīng)受體可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)構(gòu)成了阿片功能的調(diào)節(jié)系統(tǒng)［2］。外源性胍丁胺具有增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛、降低其成癮性和抗耐受作用［3］以及明顯的抗抑郁、抗焦慮作用［4］，能夠抑制阿片依賴和復(fù)吸［5］，而內(nèi)源性胍丁胺在阿片依賴發(fā)生發(fā)展中的作用尚屬未知。內(nèi)源性胍丁胺的高靈敏度、高特異性分析方法的建立，對(duì)于監(jiān)測(cè)內(nèi)源性胍丁胺在生物體內(nèi)的變化，進(jìn)而闡明內(nèi)／外源性胍丁胺作為候選神經(jīng)遞質(zhì)的基本生物學(xué)特征以及在阿片依賴和復(fù)吸發(fā)生發(fā)展中的作用具有重要意義。

胍丁胺無(wú)紫外和熒光吸收，極性大，自身難以氣化，因此在常規(guī)的氣相色譜、液相色譜及其聯(lián)用質(zhì)譜上均難以直接檢測(cè)，現(xiàn)有的檢測(cè)方法主要通過(guò)衍生化反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。目前文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)方法主要有高效 液 相 色 譜 法 （HPLC）［6－11］、氣 相 色 譜 法（GC）［12－14］、毛細(xì)管電泳法［15，16］和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）［17］等。其中，HPLC 常用衍生化試劑如鄰苯二 甲 醛－β－巰 基 乙 醇 （OPA－ME）［6，7］、萘 二 甲 醛（NDA）［8］等衍生化后，采用熒光［6－8，10］或質(zhì)譜［11］檢測(cè)器檢測(cè)，但由于衍生化后造成基底干擾嚴(yán)重，不適用于復(fù)雜基質(zhì)中胍丁胺的高靈敏檢測(cè)。GC和GCMS是較常用的檢測(cè)方法。Kawabata等［12］對(duì)比了不同的衍生化試劑包括乙酰丙酮（AA）、三氟乙酰丙酮（TFAA）以及六氟乙酰丙酮（HFAA）的衍生化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酰丙酮類(lèi)化合物能夠與胍類(lèi)進(jìn)行特異性的衍生化反應(yīng)，胍丁胺與HFAA衍生化反應(yīng)的產(chǎn)率最高，產(chǎn)物揮發(fā)度高，且穩(wěn)定性最好，是采用GC或GC－MS檢測(cè)胍丁胺的最佳衍生化試劑（胍丁胺、HFAA及其衍生化產(chǎn)物的推測(cè)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）。因此，目前基于GC技術(shù)分離檢測(cè)胍丁胺的方法均采用HFAA衍生化，通過(guò)與質(zhì)譜檢測(cè)器聯(lián)用能夠獲得較高的檢測(cè)靈敏度。

由于穩(wěn)定性同位素與被測(cè)組分化學(xué)結(jié)構(gòu)相同，僅個(gè)別元素是質(zhì)量不同的同位素，因此二者的理化性質(zhì)非常接近，能充分發(fā)揮內(nèi)標(biāo)在樣品預(yù)處理及色譜行為中的校正作用。穩(wěn)定同位素已成為質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)時(shí)的理想內(nèi)標(biāo)。劉瀟等［18］測(cè)定人血清中的多溴聯(lián)苯，劉芷彤等［19］分析環(huán)境樣品中的多氯萘，均使用了同位素內(nèi)標(biāo)。王海龍等［20］以d8－胍丁胺為內(nèi)標(biāo)，采用液相色譜－電噴霧離子阱質(zhì)譜直接檢測(cè)大鼠尿中的胍丁胺原型及乙酰化代謝產(chǎn)物，該方法不需衍生化，操作流程簡(jiǎn)單，但未見(jiàn)有效的方法學(xué)數(shù)據(jù)。Chen等［14］以15N4－胍丁胺為內(nèi)標(biāo)，HFAA 衍生化后采用GC－NCI／MS檢測(cè)。該方法檢出限低達(dá)0.01 ng／g（濕重）（計(jì)算值），但是需經(jīng)過(guò)兩次液液萃取，樣品前處理較為繁瑣。

圖1 胍丁胺（Agm）、內(nèi)標(biāo)（d8－Agm）、胍丁胺與六氟乙酰丙酮（HFAA）衍生化預(yù)測(cè)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式［15，16］Fig.1 Structures of agmatine（Agm），internal standard d8－Agm and the predicted derivatives of Agm with hexafluoroacetone（HFAA）

本文建立了大鼠血漿中內(nèi)源性胍丁胺的GCNCI／MS分析方法。以穩(wěn)定同位素標(biāo)記的d8－胍丁胺為內(nèi)標(biāo)，大鼠血漿樣品經(jīng)蛋白沉淀后直接采用HFAA衍生化，F(xiàn)lorisil固相萃取柱凈化，選擇離子模式監(jiān)測(cè)。所建立的方法簡(jiǎn)便快捷、特異性好、靈敏度高，能夠應(yīng)用于大鼠血漿中內(nèi)／外源性胍丁胺生理功能的研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 6890N GC－Agilent 5975MSD，Agilent公司，美國(guó)），配備化學(xué)電離源（CI）、自動(dòng)進(jìn)樣器及數(shù)據(jù)處理工作站；固相萃取裝置（Waters公司，美國(guó)）；固相萃取小柱（Alltech公司，美國(guó)）；2 mL頂空瓶、頂空瓶手動(dòng)封蓋器（Gerstel公司，德國(guó)）；弗羅里硅土（Florisil）填料（Alltech公司，美國(guó)）。

HFAA（純度≥98%，Sigma公司，美國(guó)）；胍丁胺硫酸鹽（純度≥99.9%）、d8－胍丁胺硫酸鹽（純度≥95%）均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所藥物合成實(shí)驗(yàn)室提供。甲醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯（色譜純，Duksan Pure Chemicals公司，韓國(guó)）；實(shí)驗(yàn)用水均經(jīng)超純水系統(tǒng)處理；分析純醋酸銨購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GC－MS條件

GC條件：色譜柱為HP－5MS毛細(xì)管柱（25 m×0.20 mm×0.33μm，Agilent公司，美國(guó)）；載氣為氦氣，恒流模式，流速為1 mL／min；進(jìn)樣口溫度為260℃；傳輸線溫度為280℃；色譜柱升溫程序：起始溫度80℃，保持1 min，以20℃／min升至280℃，保持1 min；進(jìn)樣體積為1μL，不分流進(jìn)樣，保持0.3 min。

MS條件：離子源為CI，負(fù)離子模式檢測(cè)；離子源溫度為150℃；反應(yīng)氣為甲烷；溶劑延遲時(shí)間為7 min；監(jiān)測(cè)離子為m／z 492（胍丁胺衍生物的分子離子峰）和m／z 500（d8－胍丁胺衍生物的分子離子峰）。

1.2.2 胍丁胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和工作溶液的配制

精密稱(chēng)取胍丁胺硫酸鹽10.0 mg，用超純水配制成1.00 mg／mL的儲(chǔ)備液；再將儲(chǔ)備液用超純水稀釋至20μg／mL后，用50 mmol／L醋酸銨甲醇溶液逐級(jí)稀釋成285、57.0、28.5、11.4、2.85、1.14、0.570、0.285、0.114、0.057 ng／mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 內(nèi)標(biāo)d8－胍丁胺的配制

精密稱(chēng)取d8－胍丁胺硫酸鹽17.2 mg，用D2O定容配制成1.72 mg／mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，再將儲(chǔ)備液用乙腈稀釋為50 ng／mL的工作液。

1.2.4 質(zhì)控樣品溶液的配制

將胍丁胺儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋成42.8、28.5、2.85 ng／mL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控溶液，分別取50μL，加入50 ng／mL的內(nèi)標(biāo)溶液25μL，氮吹揮干后，依次加入大鼠血漿100μL即得。

1.2.5 血漿樣品前處理

取100μL大鼠血漿，加入100μL甲醇，超聲5 min，渦旋混勻后再加入800μL乙腈，超聲5 min，渦旋混勻，于14 000 r／min下離心15 min。轉(zhuǎn)移上清液至2 mL鉗口瓶中，于45℃下蒸干，待衍生化反應(yīng)。

1.2.6 衍生化過(guò)程

將鉗口瓶置于冰上，準(zhǔn)確加入50μL HFAA和50μL乙腈，用封蓋器封蓋，超聲5 min，混勻，于100℃條件下反應(yīng)90 min。反應(yīng)后將其冷卻至室溫，于45℃條件下用氮?dú)獯蹈桑?00μL乙酸乙酯復(fù)溶。

1.2.7 衍生化產(chǎn)物的凈化

將填裝有500 mg Florisil填料的3 mL固相萃取柱置于固相萃取儀上，依次用2 mL二氯甲烷清洗、2 mL正己烷活化，將200μL乙酸乙酯復(fù)溶液上樣于固相萃取柱，靜置10 min，抽干。用500μL正己烷潤(rùn)洗鉗口瓶后二次上樣，靜置10 min，抽干。用2.5 mL二氯甲烷洗脫，收集洗脫液，徹底抽干。洗脫液于45℃條件下蒸干后，用100μL二氯甲烷復(fù)溶，取1μL進(jìn)樣。

2 結(jié)果

2.1 方法專(zhuān)屬性

胍丁胺及內(nèi)標(biāo)d8－胍丁胺標(biāo)準(zhǔn)品衍生物在全掃描模式下的典型質(zhì)譜圖如圖2所示。添加內(nèi)標(biāo)的空白溶劑及大鼠血漿樣品中胍丁胺衍生物的選擇離子監(jiān)測(cè)色譜圖如圖3所示。由此可知，在本實(shí)驗(yàn)所采用的色譜條件下，胍丁胺和內(nèi)標(biāo)衍生物的保留時(shí)間分別為8.08、8.06 min；胍丁胺衍生物的峰形良好，無(wú)內(nèi)源性雜質(zhì)峰或衍生化副產(chǎn)物干擾。同位素內(nèi)標(biāo)中不含胍丁胺（氘代率接近100%），本方法具有良好的專(zhuān)屬性。

圖2 （a）胍丁胺和（b）d8－胍丁胺標(biāo)準(zhǔn)品衍生物在SCAN模式下的典型質(zhì)譜圖Fig.2 MS spectra of（a）agmatine and（b）d8－agmatine standard derivatives in SCAN mode

2.2 胍丁胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液的線性范圍和檢出限

在 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為 285、57.0、11.4、1.14、0.570、0.285、0.114、0.057 ng／mL的100μL標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入50 ng／mL的內(nèi)標(biāo)溶液50μL，揮干并衍生化后測(cè)定，以胍丁胺的質(zhì)量濃度x（ng／mL）為橫坐標(biāo)，胍丁胺衍生物和內(nèi)標(biāo)衍生物的峰面積比值y為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，得到胍丁胺的回歸方程為y＝0.015 2x－0.018 9，r＝0.998，線性范圍為0.057～285 ng／mL。檢出限（LOD）為0.005 7 ng／mL（S／N＞3）。

圖3 添加內(nèi)標(biāo)d8－Agm的（a）空白溶劑和（b）大鼠血漿樣品衍生物的SIM色譜圖Fig.3 SIM chromatograms of the derivatives of（a）d8－Agm spiked in blank solvent and（b）Agm and d8－Agm spiked in rat plasma

2.3 血漿加標(biāo)樣品的線性范圍

在質(zhì)量濃度為57.0、28.5、11.4、5.70、2.85、1.14 ng／mL的100μL標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入50 ng／mL的內(nèi)標(biāo)溶液25μL，揮干后，加入100μL大鼠血漿，渦旋混勻，沉淀蛋白并衍生化后測(cè)定。以胍丁胺的加標(biāo)質(zhì)量濃度x（ng／mL）為橫坐標(biāo)，將胍丁胺衍生物和內(nèi)標(biāo)衍生物的峰面積比值扣除空白血漿中胍丁胺衍生物和內(nèi)標(biāo)衍生物的峰面積比值，并將該值y作為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，得到胍丁胺的回歸方程為y＝0.014 0 x－0.066 5，r＝0.997，線性范圍為1.14～57.5 ng／mL。

2.4 血漿樣品測(cè)定的精密度

配制質(zhì)量濃度為2.85、28.5、42.8 ng／mL的胍丁胺質(zhì)控樣品，衍生化并測(cè)定。每一濃度進(jìn)行6份樣本分析，連續(xù)測(cè)定3日，計(jì)算本方法的精密度，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%，符合生物樣品定量檢測(cè)的要求。

表1 大鼠血漿中胍丁胺測(cè)定方法的日內(nèi)、日間精密度Table 1 Precisions（intra－day and inter－day RSDs）of the method for the determination of agmatine in rat plasma

2.5 血漿樣品的穩(wěn)定性

將低、中、高3個(gè)加標(biāo)濃度的血漿樣品處理后于4℃下放置24 h、室溫下放置4 h以及血漿樣品于－20℃凍融循環(huán)3次，考察穩(wěn)定性。結(jié)果如表2所示，在上述條件下放置不影響胍丁胺在血漿中的穩(wěn)定性。另外，由于復(fù)溶溶劑是二氯甲烷，具有易揮發(fā)性，因此短期內(nèi)不進(jìn)行分析的樣品應(yīng)放入4℃冰箱內(nèi)保存。

表2 不同條件下血漿樣品的穩(wěn)定性（n＝3）Table 2 Stability of rat plasma sample under different storage conditions（n＝3）

2.6 血漿樣品中的回收率和基質(zhì)效應(yīng)

將血漿樣品進(jìn)行蛋白沉淀處理后分別添加低、中、高3個(gè)濃度的胍丁胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，衍生化并檢測(cè)。每一濃度進(jìn)行6個(gè)樣本的分析。與質(zhì)控樣品比較，計(jì)算胍丁胺在血漿中的回收率。同時(shí)將空白血漿基質(zhì)配制質(zhì)控樣品的測(cè)定響應(yīng)值與同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值相比較，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)表3，可見(jiàn)3個(gè)添加濃度下胍丁胺的回收率介于92.3%與108.8%之間，生物樣品的基質(zhì)效應(yīng)在72.1%～92.7%范圍內(nèi)。

表3 血漿中胍丁胺的加標(biāo)回收率及基質(zhì)效應(yīng)（n＝6）Table 3 Recoveries and matrix effects of agmatine spiked in rat plasma（n＝6）

2.7 實(shí)際生物樣品檢測(cè)

取SD大鼠10只（雌、雄各5只），眼眶取血；全血置于肝素化離心管中，于3 000 r／min下離心10 min得血漿。按所建立的方法處理血漿樣品，衍生化后進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得出血漿中內(nèi)源性胍丁胺的平均質(zhì)量濃度為（22±9）ng／mL；另外，雌、雄大鼠血漿中胍丁胺含量水平無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。

3 討論

在HFAA衍生化過(guò)程中，用吡啶作為催化劑時(shí)衍生化產(chǎn)率較高，但副產(chǎn)物較多，且對(duì)毛細(xì)管柱損害較大。我們?cè)诖嘶A(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，采用乙腈作為反應(yīng)溶劑，并優(yōu)化衍生化條件，采用固相萃取方法凈化產(chǎn)物，結(jié)果得到較大的改善。

胍丁胺與HFAA衍生化反應(yīng)后，衍生產(chǎn)物與胍丁胺相比降低了氣化溫度，使其可以在氣相色譜上達(dá)到良好的分離檢測(cè)，同時(shí)反應(yīng)后產(chǎn)物成環(huán)，增加了產(chǎn)物的穩(wěn)定性。負(fù)離子化學(xué)電離源屬于軟電離，對(duì)含電負(fù)性基團(tuán)的化合物具有高選擇性和高靈敏度。胍丁胺與HFAA的衍生化產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中有12個(gè)強(qiáng)電負(fù)性的氟原子，因此采用氣相色譜－負(fù)化學(xué)電離質(zhì)譜可實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)物的高靈敏度檢測(cè)。

4 結(jié)論

本文以穩(wěn)定同位素標(biāo)記的d8－胍丁胺為內(nèi)標(biāo)，建立了大鼠血漿中內(nèi)源性胍丁胺的同位素稀釋?zhuān)瓪庀嗌V－負(fù)離子化學(xué)電離質(zhì)譜分析方法。HFAA衍生化后的胍丁胺血漿樣品經(jīng)Florisil固相萃取柱可得到有效凈化。方法簡(jiǎn)便快速、特異性好、靈敏度高，已應(yīng)用于大鼠血漿中內(nèi)源性胍丁胺的定量檢測(cè)。

［1］ Li G，Regunathan S，Barrow C J，et al.Science，1994，263（5149）：966

［2］ Su R B，Li J，Gao K，et al.Acta Pharmacol Sin（蘇瑞斌，李錦，高凱，等.中國(guó)藥理學(xué)報(bào)），2000，21（11）：1011

［3］ Su R B，Li J，Qin B Y.Acta Pharmacol Sin（蘇瑞斌，李錦，秦伯益.中國(guó)藥理學(xué)報(bào)），2003，24（7）：631

［4］ Uzbay T I.Neurosci Biobehav Rev，2012，36（1）：502

［5］ Su R B，Ren Y H，Liu Y，et al.Eur J Pharmacol，2008，593：62

［6］ Regunathan S，Dozier D，Takkalapalli R，et al.J Pain Palliat Care Pharmacother，2009，23（1）：35

［7］ Feng Y，Halaris A E，Piletz J E.J Chromatogr B，1997，691（2）：277

［8］ Roberts J C，Grocholski B M，Kitto K F，et al.J Pharmacol Exp Ther，2005，314（3）：1226

［9］ Mayer H K，F(xiàn)iechter G，F(xiàn)ischer E.J Chromatogr A，2010，1217（19）：3251

［10］ Ozdestan O，Uren A.Talanta，2009，78（4）：1321

［11］ Nissim I，Horyn O，Daikhin Y，et al.Am J Physiol Endocrinol Metab，2002，283（6）：1123

［12］ Kawabata T，Ohshima H，Ishibashi T，et al.J Chromatogr A，1977，140（1）：47

［13］ Stickle D，Bohrer A，Berger R，et al.Anal Biochem，1996，238（2）：129

［14］ Chen G G，Turecki G，Mamer O A.J Mass Spectrom，2010，45（5）：560

［15］ Shi M，Huang Y，Li X，et al.Chromatographia，2009，70（11／12）：1651

［16］ Betancourt L，Rada P，Paredes D，et al.J Chromatogr B，2012，880：58

［17］ Huisman H，Wynveen P，Nichkova M，et al.Anal Chem，2010，82（15）：6526

［18］ Liu X，Li J G，Huang F F，et al.Chinese Journal of Chromatography（劉瀟，李敬光，黃飛飛，等.色譜），2012，30（5）：468

［19］ Liu Z T，Zhang B，Wang W W，et al.Chinese Journal of Chromatography（劉芷彤，張兵，王雯雯，等.色譜），2013，31（9）：878

［20］ Wang H L，Li J T，Li J L，et al.Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis（王海龍，李勁彤，李敬來(lái)，等.藥物分析雜志），2005，25（2）：131