康復新液對實驗性大鼠皮膚切割傷痂下愈合的影響

張 俊，孟令賀，單士軍，張理濤

（1.天津醫(yī)科大學研究生院，天津300070；2.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院皮膚科，天津300120）

康復新液是美洲大蠊提取物制成的液體制劑，成分復雜，主要為多元醇類、氨基酸及肽類活性物質(zhì)，能散淤活血、養(yǎng)陰生肌[1]。該藥在臨床上應用已久，既可內(nèi)服用于消化道潰瘍等輔助治療，又可外用于金瘡、燒傷、燙傷、瘺管、褥瘡等創(chuàng)面。普遍認為該藥能改善創(chuàng)面微循環(huán)、加速組織修復、抗菌消炎和增強免疫力[2]。然而對損傷較大的痂下愈合傷口的研究報道較少。此外，由于成分復雜，其促進創(chuàng)面愈合的具體作用機制有待進一步闡明。因此，本研究建立大鼠痂下愈合的創(chuàng)傷愈合模型，通過對創(chuàng)面組織進行取材，觀察藥物作用不同時間后，痂下愈合組織的病理學及形態(tài)學改變，探討康復新液對切割傷痂下愈合傷口的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物與試劑 康復新液：四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)，批號：110916。美寶濕潤燒傷膏：汕頭市美寶制藥有限公司生產(chǎn)，批號：111025。生理鹽水，水合氯醛，硫化鈉，酒精，二甲苯等購自天津生化試劑公司。

1.1.2 動物 清潔級Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，購自軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所，許可證號：SCX K－（軍）2009-003。

1.1.3 主要儀器設備 電子分析天平（上海天平儀器廠），光學顯微鏡（OLYMPUS，I×70日本），常規(guī)切片機，常規(guī)手術器械等。

1.2 實驗步驟

1.2.1 切割傷造模 Wistar大鼠，8%硫化鈉背部脫毛，溫水清洗后歸籠。術前一晚禁食水，手術當天10%水合氯醛（300mg/k g）腹腔注射麻醉，以大鼠背部脊柱為中線，設計一個左右對稱面積約2.5 cm×2.5 cm的正方形創(chuàng)面。75%酒精消毒后，按設計完整切除皮膚、淺筋膜，直至深筋膜淺面，徹底止血。傷后按40mL/kg體質(zhì)量腹腔注射生理鹽水行休克期復蘇，術后傷口消毒，單籠喂養(yǎng)，自由飲水取食。

1.2.2 實驗分組及給藥 大鼠造模后隨機分為4組：A組為生理鹽水陰性對照組，B組為美寶陽性對照組，C組為康復新液高劑量組（原液組），D組為康復新液低劑量組（1/2原液組），每組12只。造模0.5 h后換藥，A、C、D組以注射器滴加的方式將藥物緩慢浸沒傷口，B組以醫(yī)用棉簽均勻涂抹覆蓋創(chuàng)面，每次換藥前以75%酒精徹底消毒，清除上次殘留藥物后進行。給藥后創(chuàng)口均保持自然暴露狀態(tài)，數(shù)分鐘后歸籠。各組每天早、晚各換藥1次。

1.2.3 觀察指標和檢測方法

1.2.3.1 透明膠片法計算創(chuàng)面愈合率：于造模成功后第 0、4、7、10、14 天用無菌透明膠片覆蓋皮膚，沿創(chuàng)口邊緣描繪損傷面積的圖形，剪下相應圖形，以分析天平稱取損傷創(chuàng)口面積的膠片重量，計算損傷皮膚面積的減少率。按下列公式計算：創(chuàng)面愈合面積百分率＝（用藥前膠片重量－用藥后膠片重量）/用藥前膠片重量×100%，并拍照存證。

1.2.3.2 創(chuàng)面組織病理學檢查：于手術第4、7、14天時間點上，各組均隨機抽取3只大鼠行組織病理檢查。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，小心將創(chuàng)面全層皮膚取下，并處死大鼠。切取的組織以10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋。常規(guī)切片，蘇木精—伊紅染色（HE染色），檢測用藥不同時間后創(chuàng)傷愈合組織內(nèi)炎細胞浸潤，毛細血管生成，成纖維細胞增生及表皮增生，膠原形成等組織病理學改變。

1.3 統(tǒng)計學方法 實驗結果的計量資料用x±s表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，用單因素方差分析（one－way ANOVA），并用 q檢驗（Student-Newman-Keuls法）對數(shù)據(jù)進行兩兩比較，當P<0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義，當P<0.01時為差異非常顯著。

2 結果

2.1 康復新液對大鼠創(chuàng)傷愈合過程的影響 見圖1。各組大鼠在造模與給藥過程中無一例死亡，無明顯感染現(xiàn)象，精神狀態(tài)和活躍程度較佳。造模成功后即刻觀察，可見各組創(chuàng)傷處約2.5 cm×2.5 cm大小皮膚全層缺失，直至深筋膜，創(chuàng)面濕潤，創(chuàng)口有少許血液和漿液滲出。造模第4天，各組傷口滲出物干燥形成薄層痂皮，覆蓋創(chuàng)面，創(chuàng)口均明顯縮小，創(chuàng)緣收縮。陰性組創(chuàng)口周圍腫脹，邊緣有少許滲液。陽性組和康復新液組創(chuàng)口腫脹輕微，創(chuàng)緣分泌物少，痂皮表面干燥、呈暗紅色，觸之較軟。造模第7天，陰性組表面有滲出物，創(chuàng)緣收縮不明顯。陽性組創(chuàng)面部分痂皮脫落，可見其下方肉芽組織生長旺盛，觸之易出血。康復新液組部分大鼠創(chuàng)面痂皮局部脫落，殘留痂皮表面干燥、皺縮、呈暗紅色，觸之質(zhì)韌，邊緣不規(guī)整。造模第14天，陰性組尚有部分陳舊痂皮未脫落，其余部分為肉芽組織填充，創(chuàng)面濕潤柔軟，收縮明顯。陽性組和康復新液組創(chuàng)面陳舊痂皮完全脫落，創(chuàng)面收縮與再上皮化顯著，肉芽組織生長活躍，呈鮮紅色。創(chuàng)傷愈合期間，康復新液高、低劑量組促進創(chuàng)面愈合作用的差異性不明顯。

圖1 陰性對照組、陽性對照組、康復新液高劑量組W istar大鼠切割傷愈合情況Fig 1 Thewound healing situation of thenegative,positiveand Kangfuxin liquid high-dosegroup

2.2 切割傷創(chuàng)面愈合率 見表1，圖2。統(tǒng)計學分析顯示，在各時間點，康復新液高、低劑量組創(chuàng)面愈合百分率均明顯高于陰性組，差異有統(tǒng)計學意義（P均<0.01），而與陽性組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P均>0.05）?？祻托乱焊邉┝拷M創(chuàng)面愈合百分率高于低劑量組，但差異無統(tǒng)計學意義（P均>0.05）。

表1 各組創(chuàng)傷大鼠不同時間點創(chuàng)面愈合百分率Tab1 The healing rate of different groupsat different time points(x±s,%)

表1 各組創(chuàng)傷大鼠不同時間點創(chuàng)面愈合百分率Tab1 The healing rate of different groupsat different time points(x±s,%)

與陰性對照組相比*P＜0.01；與陽性對照組相比#P>0.05

組別 n 創(chuàng)面愈合百分率4 d 7 d 10 d 14 d陰性對照組 6 4.69±1.63 12.36±3.25 41.13±4.77 65.98±4.50陽性對照組 6 14.04±2.15*23.17±2.84*52.85±4.65*75.82±2.32*康復新高劑量組 6 14.37±2.32*#26.57±3.77*#57.41±3.99*#77.76±1.74*#康復新低劑量組 6 12.68±2.33*#24.10±2.71*#51.43±3.10*#73.68±3.62*#

圖2 各組不同時間點大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合百分率比較Fig 2 The comparison of skin wound healing rate in each group at different time points

2.3 HE染色結果 見圖3。術后第4天，各組創(chuàng)面皮膚表皮缺失，薄層血痂形成，其下有少量肉芽組織形成。陽性對照、康復新液高、低劑量組可見成纖維細胞及新生毛細血管管腔較陰性對照組豐富，而巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞的浸潤相對陰性對照組略少。術后第7天，各組創(chuàng)面陳舊痂皮下肉芽組織生成。陽性對照、康復新液高、低劑量組肉芽組織豐富，可見大量成纖維細胞，伴有膠原纖維形成，新生毛細血管多，其周圍浸潤的炎性細胞減少。其中陽性對照組和康復新液高劑量組表皮層已開始形成，其上仍覆血痂。而陰性對照組炎細胞與成纖維細胞浸潤明顯，膠原纖維形成少，間質(zhì)較疏松。術后第14天，各組創(chuàng)面已基本形成皮膚分層結構。陽性對照、康復新液高、低劑量組新生細胞已形成明顯的表皮細胞層，增生顯著，下方可看見典型毛囊結構，結締組織中成纖維細胞少而膠原纖維多，排列較整齊；陰性組仍有炎細胞浸潤，尚可見大量成纖維細胞，膠原纖維相對較少且排列紊亂。

圖3 不同時間點各組創(chuàng)面組織HE染色圖(×40)Fig 3 The HE staining figuresof thenegative,positiveand Kangfuxin high-dosegroup(×40)

3 討論

美洲大蠊作為藥用最初見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，用于治血痰癥、破積聚等?？祻托乱菏敲乐薮篌瓜x體提取物，已應用于臨床多年，最初用于燒傷、燙傷、戰(zhàn)傷等，后逐步用于消化道潰瘍、宮頸疾病、皮膚黏膜損傷及癌癥的治療[3-4]。多年臨床應用提示該藥能加快多種創(chuàng)口愈合，然而近年有研究發(fā)現(xiàn)，對于某些特殊類型的傷口，康復新液換藥時間過長，反而影響治療效果[5]。痂下愈合多見于皮膚損傷，其創(chuàng)傷表面形成褐色硬痂，愈合在痂下進行，愈合所需時間長。痂皮對傷口有保護作用的同時不利于外用藥物滲透，臨床干預措施較局限。本實驗發(fā)現(xiàn)康復新液具有較強的滲透性，對大鼠皮膚大面積切割傷痂下愈合亦有明顯促進作用。在創(chuàng)傷愈合早期能促進成纖維細胞、新生毛細血管的生長，同時能抑制創(chuàng)面炎細胞浸潤；創(chuàng)傷愈合中后期能促進肉芽組織成熟、膠原形成及表皮增生，加快陳舊血痂脫落，起到促進皮膚切割傷愈合的作用。其作用機制可能是在創(chuàng)傷愈合不同階段，通過作用于多個靶點發(fā)揮作用。

細胞外基質(zhì)(extracellularmatrixc,ECM)是創(chuàng)傷修復過程中的關鍵，主要成分有膠原蛋白、彈力蛋白、纖維連接蛋白、層黏連蛋白、基質(zhì)細胞蛋白和蛋白多糖等。細胞受到刺激后釋放的多種生長因子同樣發(fā)揮了重要作用，如表皮生長因子、轉化生長因子、成纖維細胞生長因子、血管內(nèi)皮細胞生長因子、白介素1及血小板釋放的血小板源性生長因子等。成纖維細胞是創(chuàng)面愈合中的主要修復細胞，本研究發(fā)現(xiàn)康復新液組創(chuàng)傷初期組織的成纖維細胞數(shù)量較陰性組多，提示該藥可能有促進成纖維細胞增殖或遷移的作用，推測與其含有表皮生長因子等成分有關。宋芹等[6]曾通過細胞劃痕實驗，初步探明美洲大蠊提取物對體外培養(yǎng)皮膚成纖維細胞有促進其向創(chuàng)面遷移的作用，這或許是其促進創(chuàng)面愈合的機制之一。李珊瑚等[7]認為該藥促進創(chuàng)傷愈合根本在于其原料中的W11-a12,可能是多環(huán)節(jié)地影響了生長因子、成纖維細胞及IV型膠原、纖維結合蛋白、表皮細胞、微量元素,還有ECM及多種細胞因子，從而促進創(chuàng)面修復。此外，康復新液能有效增強創(chuàng)面的牽張強度，提示該藥能增加創(chuàng)面內(nèi)膠原的產(chǎn)生與沉積，促進創(chuàng)面組織重建[8]，這與我們通過組織學檢查所得結果相符。一項動物實驗證實，本品能阻止慢性胃潰瘍病理瘢痕的形成，可能與抑制生長激素、羥脯氨酸的合成表達，優(yōu)化成纖維細胞功能有關[9]。此外，葉本蘭等[10]發(fā)現(xiàn)該藥可在一定程度上抑制放射損傷引起的鈣依賴性鉀通道開放增加，這也可能是其促進創(chuàng)面愈合的一個重要途徑。

康復新液對常見創(chuàng)面的修復有著獨到的促進作用，臨床實踐中已得到證實。但是由于其成分復雜且多變，真正的活性物質(zhì)基礎不夠明確[11]，創(chuàng)傷愈合過程中涉及多個環(huán)節(jié)、多種因子，故目前針對其促愈機制的研究還是比較淺顯，對具體的作用過程了解不夠詳細,尤其是在細胞和分子水平的研究還比較少。深入研究康復新液對創(chuàng)傷愈合過程中關鍵酶、生長因子和細胞因子表達的影響，將會進一步揭示其促進創(chuàng)傷愈合的作用機制。

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[6]宋芹,張臻,毛茜,等.美洲大蠊提取物對小鼠真皮成纖維細胞遷移影響的初步研究[J].中藥與臨床,2013,4(1):34

[7]李珊瑚,李勇敏,彭淑珍.康復新液對家兔創(chuàng)傷愈合的影響[J].臨床和實驗醫(yī)學雜志,2006,5(6):730

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