衣原體噬菌體衣殼蛋白Vp1及其高保守區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)及B細(xì)胞表位研究

姚衛(wèi)鋒，盧桂玲，謝艷秋，于 旺，宋蒙蒙，李士穎

（1.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院皮膚科，天津300120；2.天津公安醫(yī)院內(nèi)三科，天津300042）

衣原體感染與人類的多種疾病關(guān)系密切[1]，同時(shí)本身也是衣原體噬菌體的宿主。衣原體噬菌體與衣原體的關(guān)系逐漸成為研究的熱點(diǎn)。近10年發(fā)現(xiàn)的衣原體噬菌體已達(dá)5株，其20面對(duì)稱衣殼均含有3種蛋白分子,其中Vp1（virus protein1）分子量最大，在衣殼中含量最高，肽鏈長(zhǎng)度最長(zhǎng)，有形成標(biāo)志性抗原表位的良好物質(zhì)基礎(chǔ)[2]。本文旨在分析各株噬菌體Vp1氨基酸序列的保守區(qū)及其結(jié)構(gòu)信息，為實(shí)證研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 衣原體噬菌體Vp1蛋白氨基酸序列Genbank 序列號(hào)分別為 Chp2（NP＿054647.1）；Chp3（YP＿022479.1）；Chp4（YP＿338238.1）；phiCPAR39（NP＿510872.1）；phiCPG1（NP＿510872.1）。

1.2 方法 以ClustalX程序比對(duì)各株衣原體噬菌體衣殼蛋白Vp1序列獲得高保守區(qū)序列。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)應(yīng)用DNAStar軟件提供的Protean模塊進(jìn)行，采用Gamier-Robson方法、Chou-Fasman方法、Eisenberg方法和Karplus-Schulz方法分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)以7個(gè)氨基酸殘基為一組，分別按 Kyte-Doolittle、Emini和 Jameson-Wolf方案預(yù)測(cè)其親水性、表面可及性和抗原性指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 序列高保守區(qū)比對(duì)結(jié)果 衣原體噬菌體Vpl高保守蛋白序列：ClustalX序列比對(duì)結(jié)果見圖1（以Chp2Vp1氨基酸序列定位）：N端第1-215,300-565區(qū)域比對(duì)后標(biāo)為連續(xù)“*”，一致性很強(qiáng)，為高保守區(qū)；各序列第216-299位及第461-470位比對(duì)后無(wú)連續(xù)“*”“：”“.”，其間甚至出現(xiàn)比對(duì)“空溝（以“-”表示）”，序列差異顯著。

圖1 Vp1蛋白序列比對(duì)Fig 1 Vp1 protein sequencealignment

2.2 保守區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Chou-Fasman方案示：小長(zhǎng)度的α螺旋（alpha regions）稀疏散布、長(zhǎng)短不均的β折疊（beta regions）相對(duì)密集分布于序列全長(zhǎng)；相對(duì)長(zhǎng)度更短的轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（t urn r egions）在以上兩者間的全序列范圍頻繁出現(xiàn)，且該結(jié)構(gòu)與柔性區(qū)域（f le xible regions,Karplus－Schulz方法）的位置基本重疊。Gamier－Robson方案示：全序列只有3個(gè)短長(zhǎng)度α螺旋，散在分布；β折疊長(zhǎng)度比較均勻，小間隔密布于序列全長(zhǎng)，其間隔長(zhǎng)度多小于鄰近β折疊長(zhǎng)度；轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)（c oil r egions）位置也與柔性區(qū)域基本重疊，大部分富集于序列N端1-300位氨基酸殘基范圍內(nèi)，位于β折疊間隔區(qū)域，長(zhǎng)度整體上大于Chou-Fasman方案預(yù)測(cè)結(jié)果。Eisenberg方案預(yù)測(cè)α螺旋、β折疊長(zhǎng)度不均，全序列范圍疏密相間，二者位置與Gamier-Robson方案類似（圖2）。綜合3種方法：α螺旋集中區(qū)域?yàn)镹端第57-101,145-201,231-264,311-356,418-454,507-534；β折疊在全序列范圍小段密集間斷分布，富集范圍為N端第33-74,135-174,211-249,294-353,409-438,473-499,528-565。轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)在全序列范圍以小片段形式排布,富集范圍為N端第22-55,93-128,172-215,227-291,328-382,494-552。

2.3 B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果 以Kyte-Doolittle方案分析，蛋白親水性較高的區(qū)域(hydrophilicity plot)為N端第 1－11，21－32，99－111，157－167，174－197，201－208，226－233，240－254，261－269，277－300，321－333，343 －358，372 －384，416 －436，474 －501，521 －529。Jameson－Wolf法預(yù)測(cè)抗原指數(shù)（a ntigenic i ndex）較高的區(qū)域?yàn)?N 端第 1－11，21－37，52－59，99－114，123－130，160－169，173－183，189－196，203－208，214 －221，227 －234，237 －244，250 －256，261 －266，278 －292，323 －335，345 －353，373 －384，392 －399，427 －435，459 －472，478 －504，520 －531，536 －541，548－555。大多數(shù)的高抗原指數(shù)區(qū)域與預(yù)測(cè)的親水區(qū)重合。Emini方案預(yù)測(cè)氨基酸殘基蛋白質(zhì)表面可及性（s urface p robability p lot），顯示 N端第 1－8，103－110，158－164，175－183，189－196，240－244，260－266，278－283，289－299，322－332，345－357，372 －381，417 －423，427 －434，478 －488，523 －528區(qū)段很可能位于蛋白質(zhì)的表面（圖2）。

圖2 二級(jí)結(jié)構(gòu)及B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)圖Fig 2 Predict the secondary structureand B cellepitope

3 討論

迄今為止全世界已發(fā)現(xiàn)6種衣原體噬菌體，分別是 Chp1、Chp2、Chp3、Chp4、CPAR39 和 phiCPG1。第一株噬菌體Chp1發(fā)現(xiàn)后并未引起注意，隨著衣原體感染病例及衣原體耐藥性的增加，近十年衣原體的噬菌體研究逐漸引起重視，相繼發(fā)現(xiàn)了5株新的噬菌體。研究顯示衣原體噬菌體屬微病毒家族，都有20面體衣殼和單鏈核苷酸序列[3]。

衣原體噬菌體的衣殼是由Vp1、Vp2、Vp3 3種衣殼蛋白以符合熱力學(xué)定律原則對(duì)稱組裝的[2]。Vp1是分子量最大的結(jié)構(gòu)蛋白分子，其插入環(huán)IN5暴露于衣殼表面，由多肽鏈的第216和299之間的氨基酸構(gòu)成，能形成蘑菇樣的突起[4]，推測(cè)Vp1蛋白參與噬菌體與宿主的識(shí)別過(guò)程。以各株噬菌體Vp1多肽序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建種系發(fā)生樹發(fā)現(xiàn)Chp1與其他5株噬菌體的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，其他5株噬菌體分為2個(gè)亞群：分別為phiCPG1/phiCPAR39和Chp2/Chp3/Chp4。因此，我們對(duì)后5株噬菌體的Vp1蛋白序列展開分析。剔除Chp1Vp1序列后，發(fā)現(xiàn)N端第1-215,300-565區(qū)域保守度很高，未出現(xiàn)差異顯著的比對(duì)空溝，說(shuō)明這兩個(gè)區(qū)域?qū)p1蛋白分子的結(jié)構(gòu)構(gòu)成有重要價(jià)值?？紤]到噬菌體的突變率很高，上述兩個(gè)區(qū)域在各種Vp1蛋白中能保有高度一致，說(shuō)明其能穩(wěn)定遺傳、難以替代。因而對(duì)該區(qū)域的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)分析將能為尋找通用標(biāo)志物（表位）提供理論基礎(chǔ)。

相對(duì)三級(jí)/四級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的低可信度，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的可信度較高且仍在不斷改進(jìn)。Gamier-Robson法、Chou-Fasman法、Eisenberg法和Karplus-Schulz[5-6]方案都預(yù)測(cè)到蛋白的β折疊比α螺旋的數(shù)量多，可以認(rèn)為蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β折疊為主：該結(jié)構(gòu)依靠氨基酸殘基間的氫鍵形成“剛性”折疊，成為蛋白分子中心的“支架”，除特殊情況暴露于分子表面外，普遍難以被免疫系統(tǒng)識(shí)別[7]。Vp1蛋白基本的結(jié)構(gòu)骨架是β折疊組成的，α螺旋只是輔助的結(jié)構(gòu)構(gòu)成單位。轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲常常位于分子表面，因而有可能與抗體/受體作用，而且糖基化、磷酸化等蛋白加工過(guò)程也相應(yīng)成為可能[8]。轉(zhuǎn)角這種“結(jié)構(gòu)”在進(jìn)化中保守性很強(qiáng)[9]，這種“保守性”提示轉(zhuǎn)角對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)化都有重要意義。分析中發(fā)現(xiàn)Vp1蛋白除多變區(qū)外，其N端第1-215,300-565區(qū)域有頻繁出現(xiàn)的轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，說(shuō)明Vpl蛋白有較為復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，肽鏈不斷折疊、卷曲，這樣能形成大量的潛在突出于分子表面的蛋白結(jié)構(gòu)，成為潛在的蛋白間相互作用區(qū)域。

研究表明暴露于蛋白表面的區(qū)域容易被識(shí)別，潛在表位的蛋白分子表面可及性分析必不可少[10]。同時(shí)，蛋白質(zhì)分子中疏水性氨基酸殘基一般埋藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，而親水性氨基酸殘基位于蛋白質(zhì)分子表面，親水性部位分析也成為暴露區(qū)域分析的重要一環(huán)。相對(duì)肽鏈中氨基酸殘基的性質(zhì)，同時(shí)提出了抗原指數(shù)分析方案[11]?？乖笖?shù)分析結(jié)果表明有25個(gè)集中的抗原表位區(qū)域且指數(shù)值較高，并與親水性部位、表面可及性綜合分析，認(rèn)為蛋白N端第1-8,103-110,158-164,189-196,252-259,273-284,322-332,427-434,478-488是優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位。除去252-259,273-284兩個(gè)表位，其它均位于序列保守區(qū)。上述區(qū)域均避開了分析的“剛性結(jié)構(gòu)—α螺旋及β折疊”區(qū)域。

目前已經(jīng)從人類衣原體中發(fā)現(xiàn)了一株衣原體噬菌體—phiCPAR39，并觀察到其與肺炎衣原體株CPAR39的相互作用。因而對(duì)噬菌體Vp1蛋白高保守區(qū)的分析將為在更廣范圍內(nèi)尋找人類衣原體噬菌體奠定基礎(chǔ)。同時(shí)高保守區(qū)分析也為重組和建立衣原體基因輸送工具奠定了基礎(chǔ)。此外，衣原體噬菌體具有不同的、重疊的細(xì)胞嗜性特點(diǎn)—即它可以感染原來(lái)的宿主衣原體也可感染其他數(shù)種衣原體，為今后構(gòu)建多宿主敏感型重組衣原體噬菌體提供了理論支持。

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