2，4—二硝基氯苯誘導的大鼠潰瘍性結腸炎動物模型

吳星宇

近30年來，為探討一個可以用來模擬本病的模型，人們先后采用藥物學方法、免疫學方法和患者來源物質等多種方法建立了多種潰瘍性結腸炎動物模型，從不同的角度探討潰瘍性結腸炎病因、發(fā)病機制、病理改變及生物學行為等，但大多數模型為采用一定的方法，誘發(fā)產生與人潰瘍性結腸炎不同程度上相似的病理改變，但因腸道具有較強的修復能力，這些變化往往難以維持。

潰瘍性結腸炎病因和發(fā)病機制仍未闡明，這與缺少理想的動物模型有關。

一、材料與方法

（一）試驗材料

1、儀器（器械）。移液棒、注射器、灌腸儀器、手術器械、20mL帶塞刻度試管、20ul采血管、棉球、蓋玻片、白細胞計數器、顯微鏡等。

2、藥物試劑。試驗藥品：2，4-二硝基氯苯（DNCB）丙酮、乙醚苦味酸、0.85%生理鹽水等。

3、動物。健康大鼠，用混合配方飼料喂養(yǎng)，自由進食飲水，每日更換飲水，飲料，保持大鼠生活環(huán)境通風及清潔衛(wèi)生。觀察進食、飲水、活動、大小便情況，隨機分為兩組，模型組10只，對照組10只。

（二）試驗方法

1、UC模型的建立。將20只大鼠隨機分為對照組（10只）和DNCB實驗組（10只）；大鼠腹部剪毛（不損傷皮膚）約2.0cm×1.5cm，以2%DNCB涂腹液涂腹，1次/天，50μl/次，連續(xù)14天，第15天開始分別以0.2%DNCB灌腸，1次/天，每次2μl/g，連續(xù)4天，對照組灌以相應體積的60%乙醇；方法是將直徑2mm的硅膠管插入大鼠結腸，插管尖端距肛門約8cm。

2、動物觀察及評價。（1）大鼠的一般狀況。包括活動狀態(tài)、毛發(fā)變化、精神狀態(tài)、灌腸后體重下降的百分比、大便變化及便血。后三者綜合進行疾病活動指數評分（2）大鼠結腸大體形態(tài)損傷評分。在20天后處死大鼠，取出近肛門段結腸約8cm，沿縱軸剪開結腸，進行結腸大體損傷評分（3）將結腸標本進行HE染色，根據韓英等標準進行組織損傷評分

（三）統(tǒng)計學方法

數據均用均數±標準差（±S）表示 ，采用 t 檢驗和方差分析（ANVOA）進行顯著性檢驗，P〈0.05為有統(tǒng)計學意義。

二、結果

（一）大體觀察

造模完成后1～2周，模型組大鼠出現粘液膿血便或糞便稀溏、食量下降等潰瘍性結腸炎活動期常見的消化道癥狀、且逐漸加重.4周左右癥狀更為嚴重，可見膿血便、消瘦、體重減輕、毛發(fā)無光澤、飲食明顯減少、畏寒、懶動等；而對照組大鼠大小便正常、體重增加、毛發(fā)有光澤、飲食、活動精神正常。

（二）DAI評分

表1 DAI評分（±s ）

注：與正常組相比*P<0.05。

模型組的評分明顯高于對照組，差異有顯著性（P<0.01）（見表3）

（三）結腸大體形態(tài)損傷評分

模型組大鼠結腸炎癥病變主要靠近肛門段結腸，病變粘膜充血、水腫、糜爛和潰瘍形成，部分腸壁增厚，部分大鼠的結腸與周圍組織粘連，模型組評分明顯高于對照組，差異具有極顯著性（P<0.01）。見表2

表 2 兩組大鼠結腸大體形態(tài)損傷評分（±s ）

注：與正常組相比*P<0.05。

（四）病理變化

對照組：大鼠結腸粘膜完好，無炎細胞浸潤及潰瘍，粘膜上皮完整、連續(xù)、腺體排列規(guī)則、結構清楚、分泌功能活躍、粘膜下固有層內血管纖維內質對照，肌層無異常。

模型組：大鼠結腸粘膜糜爛、潰瘍，大部分粘膜缺損，有的形成深大潰瘍，粘膜腺體破壞，粘膜及粘膜下大量炎細胞浸潤，淋巴細胞散在分布，處于增殖狀態(tài)（漿多、核大、染色質稀疏），粘膜層變薄，粘膜下固有層局部充血、水腫、纖維增生。

對照組的結腸有潰瘍癥狀的為0例，模型組的結腸有潰瘍癥狀的為4例，兩組進行比較，由t檢驗可以得出P<0.05；表明大鼠在灌注DNCB灌腸液前后，在其結腸出現潰瘍的幾率上差異顯著，灌注DNCB灌腸液可使大鼠的結腸出現潰瘍癥狀的幾率顯著升高。

對照組的結腸有炎癥癥狀的為1例，模型組的結腸有炎癥癥狀的為7例，兩組進行比較，由t檢驗可以得出P<0.05；表明大鼠在注射DNCB灌腸液前后，在其結腸出現炎癥癥狀的幾率上差異顯著，灌注DNCB灌腸液可使大鼠的結腸出現炎癥癥狀的幾率顯著升高。

對照組的結腸有中性粒細胞的為1例，模型組的結腸有中性粒細胞的為6例，兩組進行比較，由t檢驗可以得出P<0.05；表明大鼠在灌注DNCB灌腸液前后，在其結腸出現中性粒細胞的幾率上有差異。

對照組的結腸有糜爛現象的為1例，模型組的結腸有糜爛現象的為3例，兩組進行比較，由t檢驗可以得出P<0.05；表明大鼠在注射DNCB灌腸液前后，在其結腸出現糜爛現象的幾率上差異顯著，灌注DNCB灌腸液可使大鼠的結腸出現糜爛現象的幾率顯著升高。

三、結果分析

（一）結腸變化

腸道2，4 -二硝基氯苯灌注部位出現粘膜和粘膜下層水腫、組織壞死， 淋巴細胞聚集，隱窩膿腫、粘膜表面潰瘍，固有層漿細胞、淋巴細胞、多形核細胞浸潤，嚴重時大鼠因巨結腸而死亡，尚未發(fā)現腸穿孔。2～5周后逐漸出現愈合期改變，潰瘍可愈合，但腺泡排列紊亂，基底部固有層有漿細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞浸潤，固有層及粘膜下層纖維組織增生。

（二）造模結果

1、大體表現。造模完成后1～2周，大鼠出現黏液膿血便或糞便稀溏、食量下降等人潰瘍性結腸炎活動期常見的消化道癥狀，以及精神萎靡、活動減少、毛發(fā)色澤暗淡等全身改變。組造模后2周黏液膿血便減少，攝食恢復，4 ～6周大便及攝食正常。

2、病理學變化

（1）肉眼觀察 造模完成后觀察的10只模型大鼠中，8只的結腸粘膜呈不同程度的充血、水腫，表面被覆粘液，血液和壞死組織，并有明顯的潰瘍形成。潰瘍的形狀、大小和深度不一，少數為細小點狀，多數成小塊狀或大片不規(guī)則狀；其中4只大鼠結腸的潰瘍僅累及粘膜，3只達粘膜下層，1只深達肌層，其余2只大鼠的結腸粘膜未見明顯的糜爛或潰瘍，但都有不同程度的充血和水腫。

（2）鏡下觀察 在8只有明顯潰瘍形成的大鼠結腸，鏡下可見潰瘍周圍的粘膜和粘膜下層組織充血、水腫，粘膜下層增后，并有大量和中等量的中性粒細胞和嗜酸性粒細胞、以及少量至中等量的大單核細胞和淋巴細胞浸潤，部分大單核細胞的胞漿內可見含鐵血黃素。潰瘍底多為富有血管的肉芽組織，其中有3只大鼠有不同程度的纖維組織增生。肌層內亦有少量至中等量的中性粒細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，偶見大單核細胞和淋巴細胞浸潤。漿膜也有少量炎性細胞浸潤。在其余2只未見明顯潰瘍的大鼠結腸，亦可見粘膜及粘膜下層組織充血、水腫，并有以淋巴細胞和嗜酸性粒細胞為主的炎性細胞浸潤。肌層內可見少量散在的淋巴細胞和嗜酸性粒細胞浸潤。

（三）分析

該期結腸的病理形態(tài)學檢查顯示，模型大鼠結腸有明顯的潰瘍形成和炎癥細胞浸潤等病理改變，造模完成后的12天為潰瘍期。并由此說明2，4-二硝基氯苯法確能成功制造大鼠潰瘍性結腸炎模型。

四、總結

本工作初步表明，應用2，4-二硝基氯苯（DNCB）方法造模，其機理是2，4-二硝基氯苯（DNCB）作為半抗原與組織蛋白結合，能誘導T細胞依賴性細胞介導的免疫反應[34]。造模后也可出現粘液膿血便等人潰瘍性結腸炎常見的癥狀，并且病理學觀察也可見到類似人潰瘍性結腸炎特點的粘膜潰瘍、隱窩膿腫形成、炎癥細胞浸潤等特征性改變，特別是其免疫學改變與人類似，是一種免疫反應的模型。

參考文獻：

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