添加載銀納米二氧化鈦光亮漆體外細(xì)胞毒性及其抗菌性的實(shí)驗(yàn)研究

曾永發(fā)　石連水　戴群　等

[摘要] 目的 研究添加載銀納米二氧化鈦（Ag/TiO2）抗菌劑對(duì)軟襯硅橡膠光亮漆體外細(xì)胞毒性及抗菌性能的影響。方法 制備直徑10 mm、厚度2 mm 的Silagum-Comfort軟襯硅橡膠圓形試樣，隨機(jī)分成6組，將Ag/TiO2按0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的重量比分別添加于光亮漆的基質(zhì)和催化劑中，均勻攪拌后分別涂布于對(duì)應(yīng)組試件表面一遍，制成含不同濃度抗菌劑的軟襯硅橡膠試件；采用噻唑藍(lán)比色法檢測(cè)軟襯硅橡膠試件對(duì)3T3細(xì)胞（小鼠胚胎成纖維細(xì)胞）的體外細(xì)胞毒性；使用粗糙度儀測(cè)量軟襯硅橡膠試件表面粗糙度值（Ra）；采用貼膜法檢測(cè)軟襯硅橡膠試件的體外抗白色假絲酵母菌性能。結(jié)果 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞毒性級(jí)別為0～2級(jí)。光亮漆的Ra值隨著抗菌劑濃度的增加有所提高，但各濃度抗菌劑組與0組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨著抗菌劑濃度的增加，抗菌率也提高；抗菌劑濃度為2.0%和2.5%時(shí)，抗菌率已達(dá)到 97.5%和96.5%。結(jié)論 Ag/TiO2光亮漆具有良好的抗菌效果，能有效改善軟襯硅橡膠的抗菌性能。

[關(guān)鍵詞] 軟襯硅橡膠； 光亮漆； 抗菌劑； 載銀納米二氧化鈦； 白色假絲酵母菌

[中圖分類(lèi)號(hào)] R 783.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.019

軟襯硅橡膠材料因具有良好的理化性能和生物相容性，被廣泛應(yīng)用在活動(dòng)義齒修復(fù)、阻塞器以及頜面贗復(fù)體中；但也存在著不足之處，如表面疏松多孔，難于清潔，易滋生霉菌（尤其是白色假絲酵母菌），引發(fā)義齒性口炎，并加速了材料的老化，降低材料性能[1]。對(duì)此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者[1-3]作了一系列相關(guān)研究，如在硅橡膠材料中添加抗生素、抗菌劑、表面處理等。

軟襯硅橡膠材料配套使用的光亮漆，其主要成分為聚乙烯硅氧烷，涂敷在軟襯表面上可形成一層連續(xù)、均勻的涂層，使材料表面更加光滑，并封閉材料表面小孔。Mainieri等[4]認(rèn)為聚乙烯硅氧烷基類(lèi)光亮漆有利于延緩軟襯材料表面老化，并提高其光潔度，延長(zhǎng)使用壽命。Ag/TiO2是一種新型的無(wú)機(jī)抗菌劑，具有抗菌譜廣、抗菌性強(qiáng)、抗菌時(shí)效性長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[5-7]?；诖?，本研究擬通過(guò)在光亮漆中加入Ag/TiO2抗菌劑，以評(píng)價(jià)其對(duì)材料體外細(xì)胞毒性和抗菌性的影響，旨在尋找一種有效的措施來(lái)提高軟襯硅橡膠的抗菌性。

1 材料和方法

1.1 材料

載銀納米二氧化鈦（安徽宣城晶瑞新材料有限公司），Silagum-Comfort軟襯硅橡膠（DMG公司，德國(guó)），便攜式表面粗糙度儀（三豐公司，日本），磁力攪拌器（95-1型，上海司樂(lè)儀器有限公司），DMEM培養(yǎng)基（Gibico公司，美國(guó)），噻唑藍(lán)（me-thyl thiazolyl diphenyl-tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞楓（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Sigma公司，美國(guó)），環(huán)境掃描電子顯微鏡（FEI Quanta 200F型， FEI公司，意大利），液體沙氏培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司），改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）。3T3細(xì)胞為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，由南昌大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室提供。實(shí)驗(yàn)菌株為白色假絲酵母菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC90028，由南京便診生物公司提供。

1.2 試件制作

在常溫23 ℃±2 ℃、相對(duì)濕度50%±5%的條件下，按照廠家要求，制備成直徑為10 mm、厚度為

2 mm的Silagum-Comfort軟襯硅橡膠圓形試樣若干個(gè)。隨機(jī)分成6組，將Ag/TiO2按0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的重量比分別添加于光亮漆的基質(zhì)和催化劑中，利用磁力攪拌器均勻攪拌2 h。均勻攪拌光亮漆基質(zhì)和催化劑10 s，然后將混合好的光亮漆按要求分別均勻涂布每個(gè)試件表面一遍，室溫固化，制成含不同濃度抗菌劑的軟襯硅橡膠試件，試件要求表面光滑、無(wú)氣泡和缺陷。各試件蒸餾水超聲振蕩洗滌10 min，分組密封裝袋，滅菌后備用。

1.3 添加Ag/TiO2后光亮漆細(xì)胞毒性研究

1.3.1 材料浸提液的制備 從每個(gè)濃度試件中隨機(jī)挑選1個(gè)表面光滑、無(wú)氣泡的軟襯試件。試件按照表面積與浸提介質(zhì)體積比（S/V）為1 cm2·mL-1浸泡于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，收集浸提液于4 ℃保存。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及MTT比色法檢測(cè) 采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3T3細(xì)胞，經(jīng)0.125%胰酶消化、吹打分散后計(jì)數(shù)，用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配制成濃度為

5.0×104個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液，按照100 μL/孔（即5×103個(gè)/孔）的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。四周邊緣孔加入100 μL/孔DMEM，作為調(diào)零孔。接種24 h后，取出96孔板，棄去舊培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組（0組，0.5%組，1.0%組，1.5%組，2.0%組，2.5%組）分別加入50%及100%的材料浸提液，100 μL/孔；陰性對(duì)照組加入含10%小牛血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基，100 μL/孔；陽(yáng)性對(duì)照組加入0.064%苯酚溶液，100 μL /孔。每組設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并放置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。48 h以后每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)5 h，吸出原培養(yǎng)液加入DMSO 150 μL /孔，室溫下振蕩器振蕩15 min，充分溶解結(jié)晶物，最后采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的光吸收值（OD值），實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)為490 nm。通過(guò)下式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率（relative growth rate，RGR），RGR=實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞計(jì)數(shù)/陰性對(duì)照組細(xì)胞計(jì)數(shù)×100%。將各濃度組RGR轉(zhuǎn)化為0～4級(jí)材料毒性評(píng)級(jí)（cyto-xicity scale，CTS）[8]。當(dāng)RGR≥100%、80%～99%、50%～79%、30%～49%、0～29%時(shí)，分別對(duì)應(yīng)細(xì)胞毒性等級(jí)0、1、2、3、4級(jí)。

1.4 添加Ag/TiO2后光亮漆表面粗糙度的測(cè)試

從每一濃度組及未涂布光亮漆組選3個(gè)試件使用粗糙度儀進(jìn)行表面粗糙度測(cè)試，以輪廓算術(shù)平均偏差（Ra）作為表面粗糙度評(píng)定參數(shù)。所有測(cè)試試件經(jīng)超聲清洗10 min后自然風(fēng)干，試件測(cè)試面朝上置于平臺(tái)上。設(shè)定取樣長(zhǎng)度為0.8 mm，評(píng)定長(zhǎng)度為4.0 mm，滑行速度為1 mm·s-1。傳感觸針與試件表面垂直。每一試件隨機(jī)測(cè)3個(gè)點(diǎn)，取其平均值。

1.5 抗菌效能測(cè)試

1.5.1 實(shí)驗(yàn)菌液配制 采用接種環(huán)從連續(xù)傳代培養(yǎng)2次后的白色假絲酵母菌（于48 h 內(nèi)轉(zhuǎn)接）培養(yǎng)基上挑取少量（刮1～2環(huán)）新鮮菌落，混懸于生理鹽水中，通過(guò)比濁儀配制成1.0×108 CFU·mL-1的白色假絲酵母菌菌液，然后用液體沙氏培養(yǎng)基稀釋成1.0×106 CFU·mL-1的菌懸液備用。

1.5.2 貼膜法評(píng)價(jià)抗菌性能 將試件置于直徑60 mm的培養(yǎng)皿中，用微量移液器分別取20 μL菌懸液滴于每個(gè)試件表面，覆蓋已消毒的聚乙烯薄膜，鋪平，使菌液均勻接觸樣品表面，置于37 ℃、相對(duì)濕度大于90%的培養(yǎng)箱里孵育24 h。隨后每個(gè)平皿加入5 mL無(wú)菌生理鹽水洗脫液，置于渦旋混合器上劇烈振蕩5 min，充分洗脫附著于試件及覆蓋膜上的白色假絲酵母菌，充分混勻洗脫液，取100 μL接種至固體改良馬丁瓊脂平板上，需氧培養(yǎng)24 h，采用菌落形成單位（colony-forming units，CFU）進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3組平行組，取平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.3 抗菌效能評(píng)價(jià) 參照中華人民共和國(guó)輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T2591—2003方法評(píng)價(jià)抗菌效能[9]，計(jì)算公式如下：抑（殺）菌率=（A0-A）/A0×100%，其中A0為對(duì)照樣品平均回收菌數(shù)，A為實(shí)驗(yàn)樣品平均回收菌數(shù)。若抑菌率大于等于50%小于90%，表示實(shí)驗(yàn)樣品有抑菌作用；若抑菌率大于等于90%，表示實(shí)驗(yàn)樣品有較強(qiáng)殺菌作用。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組數(shù)據(jù)的描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組的比較選用單因素方差分析，組間的兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若數(shù)據(jù)的結(jié)果不滿(mǎn)足正態(tài)分布，則采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)分析不同組間的分布差異。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測(cè)定結(jié)果

細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，可見(jiàn)陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞數(shù)明顯降低，細(xì)胞胞體圓縮，大量壞死、崩解；陰性對(duì)照組細(xì)胞輪廓清晰，呈梭形或多角狀，胞質(zhì)透明、較大，細(xì)胞數(shù)明顯增加；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯異常，可見(jiàn)少量的細(xì)胞碎片和胞體圓縮（圖1）。

細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，各實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組的OD值與陽(yáng)性對(duì)照組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=24.046，P=0.000；F=16.499，P=

0.001）；除1.5%組的50%濃度浸提液，1.5%組、2.0%組、2.5%組的100%浸提液（P<0.05）外，其余各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞毒性級(jí)別為0～2級(jí)。

2.2 添加Ag/TiO2后光亮漆表面粗糙度的測(cè)試結(jié)果

0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%組及未涂布光亮漆組的Ra值大小依次為：0.363±0.088、0.375±0.073、0.381±0.104、0.392±0.093、0.403±0.109、0.448±0.071、0.415±0.092。Ra值隨著抗菌劑濃度的增加有所提高，但各濃度抗菌劑組與0%組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=7.377，P=0.287）。

2.3 抗菌效能檢測(cè)結(jié)果

各組對(duì)白色假絲酵母菌的抗菌結(jié)果見(jiàn)表2、圖2。隨著抗菌劑濃度的增加，抗菌率提高；抗菌劑濃度為2.0%和2.5%時(shí)，抗菌率已達(dá)到 97.5%和96.5%。

3 討論

3.1 Ag/TiO2無(wú)機(jī)抗菌劑的選擇

Ag/TiO2是一種新型無(wú)機(jī)抗菌劑，具有抗菌譜廣、殺菌力強(qiáng)、安全、持久、無(wú)耐藥性等特點(diǎn)。Ag/TiO2是以工業(yè)偏鈦酸為原料制備成納米偏鈦酸后，采用物理和化學(xué)方法防止顆粒在干燥和鍛燒過(guò)程中團(tuán)聚長(zhǎng)大，利用分子活化作用，將銀嵌入TiO2晶體，使兩者的光催化抗菌性能相結(jié)合[10]。Ag+沉積到納米TiO2表面，一方面可有效防止TiO2光催化時(shí)產(chǎn)生電子-空穴對(duì)復(fù)合，提高TiO2的光催化活性；一方面又可與其酶蛋白中的-SH結(jié)合，致使代謝關(guān)鍵酶失活，細(xì)菌無(wú)法代謝而死亡[11]；同時(shí)，Ag+還可與致病菌DNA堿基結(jié)合并形成交叉鏈接，置換嘌呤和嘧啶中相鄰氮之間的氫鍵，使DNA變性而不能復(fù)制，導(dǎo)致致病菌失活。

Ag/TiO2抗菌劑避免了一般銀系抗菌劑殺菌后產(chǎn)生的內(nèi)毒素造成的后期污染，并克服了納米TiO2抗菌活性光照條件的限制，實(shí)現(xiàn)了Ag+的緩釋?zhuān)瑥亩娱L(zhǎng)了殺菌功效；同時(shí)也可避免普通銀系抗菌劑存在的氧化后易變黑等問(wèn)題[7]。

在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)有Ag/TiO2抗菌劑應(yīng)用的相關(guān)研究，如陳良建等[12]將Ag/TiO2粉末按不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加至硅橡膠中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：添加Ag/TiO2后硅橡膠具有良好的抗菌性能，而且無(wú)細(xì)胞毒性，對(duì)細(xì)胞的黏附也無(wú)影響。劉杰等[13]將Ag/TiO2添加于義齒樹(shù)脂基托材料中，結(jié)果顯示可以顯著提高樹(shù)脂基托抗菌性能，而且抗菌效果持久穩(wěn)定。

3.2 添加Ag/TiO2后光亮漆體外細(xì)胞毒性研究

MTT比色法是一種能快速檢測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性的比色分析法，已被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物毒理學(xué)和醫(yī)用材料的生物相容性評(píng)價(jià)。MTT比色法的原理：活細(xì)胞線(xiàn)粒體中的琥珀酸脫氫酶能還原外源性MTT，使其成為非水溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物——甲瓚并沉積于細(xì)胞中，死細(xì)胞則不具備此功能；加入DMSO后能溶解細(xì)胞中的甲瓚，最后采用酶標(biāo)儀測(cè)定其OD值。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，形成的MTT結(jié)晶量與活細(xì)胞數(shù)成正比關(guān)系；因此，根據(jù)測(cè)得的OD值可判斷活細(xì)胞數(shù)量[14]。本研究結(jié)果顯示：材料的細(xì)胞毒性隨著抗菌劑濃度的提高有所增強(qiáng)，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)為0～2級(jí)，均符合國(guó)家醫(yī)療器械檢測(cè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[8]。本結(jié)果與任艷云等[15]和陳良建等[8]的研究結(jié)果相一致。

3.3 添加Ag/TiO2后對(duì)光亮漆表面粗糙度的影響

粗糙的表面可為微生物的滯留和感染提供條件，在此部位微生物可受到保護(hù)，抵抗機(jī)械性應(yīng)力的清洗；同時(shí)粗糙的表面可提供較大的表面積，使黏附的菌量更大。鄧華頡等[16]研究表明軟襯材料表面的光滑度可影響白色假絲酵母菌在材料表面的黏附，白色假絲酵母菌的黏附量和材料表面粗糙度呈正相關(guān)，光滑面較粗糙面黏附少。Zissis等[17]研究認(rèn)為軟襯表面粗糙度值低于0.2 μm時(shí)未發(fā)現(xiàn)菌斑附著，他們認(rèn)為這是軟襯材料無(wú)菌斑積累和黏附的一個(gè)臨界閾值。由于軟襯材料不易拋光的特點(diǎn)，表面粗糙度都較高，易黏附和滋生菌斑。

通過(guò)表面粗糙度儀可以將粗糙度量化表征，常用的表面粗糙度評(píng)定參數(shù)有微觀不平度十點(diǎn)高度（Rz）、Ra和輪廓最大高度（Ry）。本實(shí)驗(yàn)選用Ra值來(lái)表征所測(cè)試件的表面粗糙度，結(jié)果直接、準(zhǔn)確和客觀，便于量化分析。從結(jié)果可以看出，光亮漆的Ra值隨著抗菌劑濃度的增加有所提高，但相比0組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。未涂布光亮漆組Ra值也明顯高于0%組，說(shuō)明光亮漆能降低材料的表面粗糙度。

3.4 抗菌效能的檢測(cè)

Ag/TiO2抗菌劑的添加量是抗菌光亮漆應(yīng)用于臨床需確定的重要參數(shù)之一，增加抗菌劑的添加量有助于提高材料的抗菌性能，但過(guò)量可能會(huì)影響原材料性能。貼膜法能定量描述材料抗菌性能，具有簡(jiǎn)便易于掌握、結(jié)果重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，是目前常用的抗菌性能檢測(cè)方法之一[18]。本研究采用貼膜法檢測(cè)材料的抗菌性能，結(jié)果顯示：隨著Ag/TiO2添加量的增加，抗菌率也隨之提高，當(dāng)Ag/TiO2添加劑為2.0%和2.5%時(shí)，抗菌率已達(dá)到97.5%和96.5%。這可能與光亮漆表面Ag/TiO2的暴露量有關(guān)，濃度較低時(shí)，Ag/TiO2暴露量有限，抗菌率也低；抗菌劑添加量增加時(shí)，抗菌率也隨之提高，當(dāng)Ag/TiO2添加量達(dá)到2.0%以上時(shí)即具有良好的抗菌性。

綜上，本研究認(rèn)為添加Ag/TiO2光亮漆能有效地提高硅橡膠軟襯材料的抗菌性，而且細(xì)胞毒性小。Ag/TiO2的添加量為2.0%時(shí)抗菌性最佳，而且表面粗糙度也無(wú)明顯的改變。但是硅橡膠軟襯平均使用壽命為1～2年，本實(shí)驗(yàn)僅證明添加Ag/TiO2后材料短期內(nèi)具有抗菌性，隨著時(shí)間的推移，光亮漆中添加的Ag/TiO2可能會(huì)溶解游離出來(lái)，降低其抗菌濃度，進(jìn)而影響遠(yuǎn)期的抗菌性。關(guān)于這一點(diǎn)學(xué)者進(jìn)行過(guò)相關(guān)研究，葛亞麗等[19]對(duì)添加Ag/TiO2的抗菌基托進(jìn)行自然老化和加速老化熱處理，認(rèn)為其抗菌效果持久穩(wěn)定。關(guān)于添加抗菌劑后對(duì)光亮漆的機(jī)械、物理性能是否會(huì)產(chǎn)生影響，還有待于進(jìn)一步的研究。

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（本文編輯 李彩）