刺激響應(yīng)型抗菌劑研究進展及在膠原抗菌防腐中應(yīng)用展望

孫莎莎，侯德隆，楊高夫，陳意

（四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610065）

前言

膠原是細胞外基質(zhì)的主要成分，其化學(xué)、空間結(jié)構(gòu)獨特，兼具低免疫原性、可生物降解性、止血和修復(fù)功能[1-2]，在當代組織工程、醫(yī)美等領(lǐng)域占據(jù)重要地位。

然而，膠原蛋白是一種富營養(yǎng)的生物大分子，極易受細菌等微生物侵蝕。研究表明，細菌新陳代謝會產(chǎn)生多種蛋白酶，進而破壞膠原化學(xué)、空間結(jié)構(gòu)，使其凝血、促細胞粘附和增殖等生物活性降低[3]。此外，膠原器件中累積的微生物代謝產(chǎn)物中含多種有害物質(zhì)，對使用者的健康也會造成威脅[4-5]。因此，抗菌防腐是天然膠原作為醫(yī)用材料高值利用的必要前提。

長期以來，通過外添加抗菌劑以提高膠原的抗菌防腐性被證明是一種行之有效的方法。然而，常用抗菌劑大多具有生理毒性；臨床應(yīng)用時，膠原器件所含抗菌劑可能引發(fā)過敏、炎癥、神經(jīng)紊亂、甚至腎臟損傷等不良反應(yīng)[6-9]，破壞膠原固有生物相容性。與此同時，這些膠原器件被丟棄后，所含抗菌劑仍有活性，其環(huán)境累積可能造成細菌耐藥性產(chǎn)生[10]。

為解決上述問題，從上世紀50年代開始，相關(guān)研究主要圍繞低毒、低耐藥性新型抗菌劑的研發(fā)、使用而展開，但面臨投資大、風(fēng)險高、周期長、收益低等問題[11]。

為傳統(tǒng)抗菌劑分子設(shè)置活性開關(guān)是按需規(guī)避其生理毒性、抑制耐藥性產(chǎn)生的另一有效途徑。諾貝爾化學(xué)獎得主Ben L.Feringa 教授是這一研究方向的倡導(dǎo)者和奠基人。他曾指出[12]：“That is a whole new way of thinking about drug research—這是一種（抗菌劑）藥物研究的全新方式”，同時呼吁“New approaches are needed…stimulate others to find better original solutions—（該領(lǐng)域）需要新的（開關(guān)）方法…（希望能）激發(fā)他人找到更好的原創(chuàng)解決方案”。過去十年間，科學(xué)家們通過設(shè)計高效、高選擇性化學(xué)反應(yīng)，已將一系列響應(yīng)基團引入抗菌劑分子，利用光、溫度、pH、磁、主客體等外部刺激，實現(xiàn)了對抗菌劑活性的按需開關(guān)控制，已取得的研究進展為解決抗菌劑的毒性及耐藥性問題提供了新思路，在膠原等生物質(zhì)材料的抗菌防腐中具有應(yīng)用前景。

1 光響應(yīng)型抗菌劑

在各種外部刺激中, 光刺激具有時空分辨率高、遠程操控性強、強度/波長易控制等優(yōu)點[13-15]。鑒于此，在抗菌劑分子中引入特定的感光基團，可以使其結(jié)構(gòu)、物化性質(zhì)對光產(chǎn)生響應(yīng)性變化，從而實現(xiàn)抗菌劑活性開關(guān)控制。

2000年，美國韋恩州立大學(xué)的Lee 等人[16]首次報道了一種光致失活型β-內(nèi)酰胺抗菌劑。該抗菌劑的分子結(jié)構(gòu)中具有一個活性肼，并受到光敏鄰硝基芐酯保護。正常狀態(tài)下，該抗菌劑具有廣譜抗菌活性；當其進入環(huán)境后，在可見光照射下，鄰硝基芐酯會在數(shù)小時后全部斷裂，暴露后的活性肼隨即與抗菌劑中內(nèi)酰胺羰基反應(yīng)成環(huán)。該環(huán)狀結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定，會繼續(xù)發(fā)生降解反應(yīng)，導(dǎo)致抗菌劑失活，可有效避免活性抗菌劑在環(huán)境中累積引起耐藥性。然而，上述策略須將鄰硝基芐酯保護的活性肼引入抗菌劑分子特定位置，合成步驟較為繁瑣；與此同時，改性后的抗菌劑活性是否能達到抗菌劑原有水平，Lee等人并未在其文章中明確說明。

上述光致失活策略雖行之有效，但并不具有普適性，因為并非所有抗菌劑都具備分子內(nèi)成環(huán)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。鑒于此，科研工作者開始探索其他更具普適性的抗菌劑改性及活性調(diào)控方法。2013年，荷蘭Ben L.Feringa 課題組的Velema 等人[17]發(fā)現(xiàn)，將芳基偶氮共價連接于喹諾酮抗菌劑苯環(huán)后，喹諾酮的抗菌活性在紫外光（λ=365 nm）照射前后有明顯變化：照射前，該抗菌劑對大腸桿菌和滕黃微球菌的最小抑菌濃度（MIC） 分別為＞64 μg/mL 和16 μg/mL；照射后，對上述菌種的MIC 分別下降至16 μg/mL 和2 μg/mL，抗菌活性顯著上升。雖然Velema等人并未說明造成這一現(xiàn)象的根本原因，但猜測與芳基偶氮光致反→順異構(gòu)有關(guān)。更為重要的是，在紫外光照射后，芳基偶氮受熱會恢復(fù)至反式構(gòu)象，導(dǎo)致抗菌劑失活，即：這類抗菌劑在發(fā)揮完抗菌作用后會自動失活，可避免活性抗菌劑在環(huán)境中累積并造成耐藥性。

因紫外光具有細胞毒性[18]，且穿透深度不足[19]，限制了其實際應(yīng)用。為解決這一問題，2017年，Ben L. Feringa 課題組的Wegener 等人[20]又以甲氧芐氨嘧啶為模型抗菌劑，使用氯代偶氮苯對其非藥效基團進行光可異構(gòu)化改性，獲得了可在綠、紫或紅光光照射下發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變的刺激響應(yīng)型抗菌劑。其中，基于紅光刺激的氯代偶氮苯改性甲氧芐氨嘧啶照射前對大腸桿菌的MIC＞80 μM，照射后MIC 降至10 μM，抗菌活性提高至少8 倍。由于可見光無毒、穿透性更強，上述工作為實現(xiàn)光響應(yīng)抗菌劑在生理條件下的實際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

Ben L.Feringa 課題組的研究工作證實，將光敏基團共價偶聯(lián)于抗菌劑非藥效基團，可在光刺激下實現(xiàn)多種抗菌劑活性開關(guān)控制。這一設(shè)計思路看似具有普適性，但光敏基團被永久固定于抗菌劑分子中，已破壞了抗菌劑原有化學(xué)、空間結(jié)構(gòu)。因此，研究人員發(fā)現(xiàn)，即使處于“開啟”狀態(tài)，這些光敏抗菌劑的活性已無法再現(xiàn)改性前水平[21]。為此，2020年，四川大學(xué)的Hou 等人[22]報道了一種全新的光響應(yīng)抗菌劑設(shè)計方法，即將光敏鄰硝基芐酯直接偶聯(lián)于環(huán)丙沙星3-羧基，利用鄰硝基芐酯暫時掩蔽抗菌劑母核及其光致分解特性，同時實現(xiàn)高開關(guān)比與“開啟”狀態(tài)下環(huán)丙沙星強抗菌活性再現(xiàn)。實驗結(jié)果顯示，母核改性后的環(huán)丙沙星MIC提升至8.0 μM，其抗菌活性被鄰硝基芐酯大幅掩蔽。高效液相色譜檢測結(jié)果表明，在365 nm 紫外光照射下，鄰硝基芐酯隨之斷裂，抗菌劑MIC 降至0.5 μM（開關(guān)比=16），與環(huán)丙沙星原有抗菌活性基本相當，即其抗菌活性可光控激活。這種光響應(yīng)抗菌特性在活死細胞染色、紫外光隨機引入、細菌圖案化生長實驗中得到了進一步證實。上述設(shè)計思路基于鄰硝基芐酯光解反應(yīng)機理，以保留抗菌劑原有活性、獲得高開關(guān)比為目的，為解決前人光響應(yīng)抗菌劑設(shè)計中存在的共性問題提供了借鑒。2021年初，瑞士蘇黎世大學(xué)的Shchelik 等人[23]采用這種掩蔽抗菌劑母核的策略，實現(xiàn)了萬古霉素和頭孢菌素兩類抗菌劑的光致激活。

2 熱響應(yīng)型抗菌劑

醫(yī)用膠原器件通常儲存于低溫水介質(zhì)中，一旦與活組織接觸，將立即升溫至35～37 ℃。這一自然溫差為科研工作者設(shè)計熱響應(yīng)抗菌劑，實現(xiàn)膠原所含抗菌劑活性“自適應(yīng)”調(diào)節(jié)提供了有利條件。

革蘭氏陰性菌外膜外側(cè)被具有準晶態(tài)結(jié)構(gòu)的脂多糖占據(jù)，滲透性極低；許多具有胞內(nèi)靶標的抗菌劑（如磺胺類、喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類等）在跨細菌外膜轉(zhuǎn)運時，須利用外膜孔蛋白作為非特異性通道；這些孔蛋白的內(nèi)腔直徑固定（0.7～1.2 nm），具有尺寸選擇性，只允許短小的線型親水分子通過，對長度或截面積超限的分子則具有阻透作用[24]。

受細菌外膜孔蛋白對滲透物的尺寸選擇性啟發(fā)，四川大學(xué)的Chang 等人[25]利用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合技術(shù)，控制N-異丙基丙烯酰胺和N-丙烯酰化環(huán)丙沙星順序聚合，將熱敏聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）共價偶聯(lián)到環(huán)丙沙星分子上，利用PNIPAM 在低臨界溶解溫度上下的伸展- 塌縮構(gòu)象轉(zhuǎn)變，控制環(huán)丙沙星跨外膜與其胞內(nèi)靶標接觸的能力，實現(xiàn)對環(huán)丙沙星抗菌活性的溫控調(diào)節(jié)（如圖1 所示）。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當PNIPAM 的數(shù)均相對分子質(zhì)量從2592 增加到10 190 時，在開關(guān)溫度（33 ℃）以下，熱響應(yīng)環(huán)丙沙星對野生型大腸桿菌的MIC 從6 μg/mL 降至1.5 μg/mL，而在開關(guān)溫度以上，其MIC 由96 μg/mL 降至3 μg/mL，即開關(guān)比隨PNIPAM 分子量增加由16 降至2。與野生型大腸桿菌相比，熱響應(yīng)環(huán)丙沙星對孔蛋白缺失型大腸桿菌的MIC 在開關(guān)溫度上下沒有明顯差異，證實外膜孔蛋白參與控制熱響應(yīng)環(huán)丙沙星與胞內(nèi)靶標接觸。

圖1 PNIPAM 改性環(huán)丙沙星抗菌劑合成路線及產(chǎn)物抗菌活性溫控開關(guān)機制[25]

為揭示上述熱響應(yīng)抗菌劑的工作機制，Chang等人進一步采用動/靜態(tài)光散射、X 射線光電子能譜、熒光標記法及流式細胞術(shù)證實：在開關(guān)溫度以下，PNIPAM 鏈呈現(xiàn)伸展構(gòu)象，垂直于其長度方向具有較小的橫截面，此時的熱響應(yīng)型環(huán)丙沙星可穿過外膜孔蛋白內(nèi)腔與其胞內(nèi)靶標接觸，具有抗菌活性；在開關(guān)溫度以上，PNIPAM 鏈受熱塌縮成球體，熱響應(yīng)環(huán)丙沙星尺寸大于孔蛋白內(nèi)徑，無法透過孔蛋白與其胞內(nèi)靶標接觸，其抗菌活性得以掩蔽。

由于上述熱響應(yīng)抗菌劑的開關(guān)溫度（約32 ℃）正好在醫(yī)用膠原存儲溫度與活組織溫度之間，Chang 等人[26]進一步提出：可將上述熱響應(yīng)抗菌劑共價固定于膠原表面，利用醫(yī)用膠原存儲溫度與活組織溫度間自然溫差，實現(xiàn)膠原儲存穩(wěn)定性與使用安全性“自適應(yīng)”調(diào)節(jié)。在低溫存儲條件下，固定于膠原表面的熱響應(yīng)環(huán)丙沙星處于伸展狀態(tài)，仍可利用細菌外膜孔蛋白通道進入胞內(nèi)發(fā)揮抗菌作用，保證膠原器件不受微生物侵蝕；一旦與活組織接觸，上述熱響應(yīng)抗菌劑受生理溫度影響迅速塌縮，環(huán)丙沙星由于無法通過孔蛋白而失活，其毒副作用隨之屏蔽。上述“自適應(yīng)”抗菌模式無需任何物理或化學(xué)干涉即可進行，為解決天然膠原抗菌防腐必要性與維持生物相容性完整間由來已久的矛盾提供了新思路。

當然，PNIPAM 共價偶聯(lián)會改變抗菌劑原有化學(xué)結(jié)構(gòu)，既影響抗菌劑抗菌活性，合成步驟又較為繁瑣。直接以熱敏PNIPAM 為抗菌劑載體可很好地解決上述問題。例如，Hathaway 等人[27]直接將溶葡萄球菌酶和噬菌體內(nèi)吞酶兩類抗菌劑負載于PNIPAM納米顆粒。在低溫狀態(tài)下，兩類抗菌劑被限制在PNIPAM 納米顆粒內(nèi)，處于“失活”狀態(tài)；在開關(guān)溫度以上，PNIPAM 受熱收縮，可將噬菌體內(nèi)吞酶和溶葡萄球菌酶釋放出來，并在特定部位聚集，發(fā)揮協(xié)同抗菌作用，表現(xiàn)出受溫度控制的抗菌活性開關(guān)。

3 pH 響應(yīng)型抗菌劑

一般而言，抗菌劑的結(jié)構(gòu)、物化性質(zhì)非常穩(wěn)定，不會隨環(huán)境pH 值發(fā)生改變。因此，為制備pH 值響應(yīng)型抗菌劑，只能將抗菌劑負載于pH 敏感的膠束、納米顆?；蛩z中，利用上述載體在環(huán)境pH 變化前后性質(zhì)突變，實現(xiàn)抗菌劑按需釋放，進而“打開”其抗菌活性。

例如，Sonawane 等人[28]制備了一種新型AB2 型兩親嵌段共聚物，其親水和親油端由pH 值敏感型腙鍵連接。在水相中，上述共聚物會自動形成膠束，并將萬古霉素抗菌劑包覆于疏水內(nèi)核中。當環(huán)境pH 值由7.4 下降到6.0 時，腙鍵逐漸斷裂，造成膠束解體，萬古霉素抗菌劑隨即從膠束中釋放出來。通過這種方式，可按需調(diào)控所需抗菌劑濃度，實現(xiàn)抗菌劑活性開關(guān)控制。

除此之外，Pichavant 等人[29]利用聚乙二醇將硫酸慶大霉素抗菌劑與降冰片烯偶聯(lián)，再以上述偶聯(lián)體、降冰片烯為單體，通過開環(huán)易位共聚反應(yīng)，合成出pH 響應(yīng)型抗菌納米顆粒。這種智能抗菌材料正常工作的關(guān)鍵在于：硫酸慶大霉素通過pH 敏感的亞胺鍵與聚乙二醇偶聯(lián)。當環(huán)境pH 值由7.0 下降至4.0 時，起連接作用的亞胺鍵隨即斷裂，進而實現(xiàn)硫酸慶大霉素按需釋放。受此影響，上述納米顆粒對表皮葡萄球菌的MIC 由108 μg/mL 下降至10 μg/mL，其抗菌功能受環(huán)境pH 值變化顯著增強。

4 磁響應(yīng)型抗菌劑

將抗菌劑負載于磁性納米粒子上，可制得磁響應(yīng)型抗菌劑。這類抗菌劑具有兩種工作模式：首先，在磁場作用下，抗菌劑的局部濃度會發(fā)生突變，表現(xiàn)出突然增強的抗菌活性。例如，Pageni 等人[30]利用表面引發(fā)可逆加成- 斷裂鏈轉(zhuǎn)移自由基聚合法（RAFT），將含鈷金屬聚合物接枝到磁性四氧化三鐵納米粒子表面，再通過靜電相互作用將青霉素-G與該金屬聚合物結(jié)合（如圖2 所示）。實驗發(fā)現(xiàn)，施加外部磁場前，青霉素-G 較為分散，局部濃度不足以殺滅細菌；在施加外部磁場后，由于青霉素-G 在局部富集，具有良好的抗菌效果，能有效殺滅金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌和肺炎克雷伯菌。

圖2 表面引發(fā)RAFT 聚合法制備含青霉素-G 磁性四氧化三鐵抗菌材料[30]

其次，當磁性抗菌劑完成抗菌使命后，也可利用磁場作用，將抗菌劑重新富集以減少其環(huán)境累積。例如，四川大學(xué)Chang 等人[6]利用環(huán)丙沙星非藥效仲胺基團與丙烯酰氯間酰胺化反應(yīng)，制備出N-丙烯酰化環(huán)丙沙星；然后，基于N-丙烯?；h(huán)丙沙星與丙烯酸間自由基共聚反應(yīng)，將環(huán)丙沙星固定于乙烯基改性的納米四氧化三鐵表面，利用納米四氧化三鐵的磁響應(yīng)特性，實現(xiàn)了環(huán)丙沙星在膠原溶液中的可控回收，為解決活性抗菌劑在膠原溶液中的殘留問題提供了技術(shù)支撐。

5 主客體響應(yīng)型抗菌劑

基于分子識別的主客體化學(xué)是一門發(fā)展迅速的新興交叉學(xué)科，是當今科學(xué)研究的熱點之一。近年來，基于主客體反應(yīng)制備刺激響應(yīng)型抗菌劑也取得了一定進展。

葫蘆[7]脲（CB[7]）是由七個苷脲單元通過亞甲基橋聯(lián)而成的剛性大環(huán)化合物，具有一個疏水空腔和兩個由羰基環(huán)繞而成的富電子洞口，可依靠疏水作用、離子-偶極相互作用，選擇性包合與其極性、大小匹配的化合物[31]。利用葫蘆[7]脲主客體相互作用，中科院Shu Wang 課題組的Bai 等人[32]開發(fā)了一種超分子抗菌劑活性開關(guān)。他們采用的抗菌劑為帶季銨陽離子基團（QA）側(cè)鏈的聚（亞苯基亞乙烯基）衍生物（PPV），其側(cè)鏈季銨陽離子基團可殺滅細菌。當CB[7]將QA 側(cè)鏈超分子包合時，PPV 的抗菌活性隨之關(guān)閉；在加入能與CB[7]競爭結(jié)合的金剛烷胺后，QA 側(cè)鏈隨之暴露，并重新表現(xiàn)出抗菌活性（如圖3 所示）。通過這種方式，可實現(xiàn)抗菌劑生物活性的按需打開與關(guān)閉，且無需對抗菌劑進行任何化學(xué)修飾，具有方法簡單、快速高效的特點。基于類似的響應(yīng)機制，Shu Wang 課題組的Huang 等人[33]還通過控制CB[7]主體添加量，實現(xiàn)了聚-L-賴氨酸客體抗菌活性強弱按需控制。

圖3 基于主客體相互作用的PPV 抗菌劑活性開關(guān)工作機制[32]

由于空腔尺寸較大，葫蘆[8]脲能在保證高結(jié)合常數(shù)的同時包合兩個客體分子[34]。鑒于此，Li 等人[35]利用葫蘆[8]脲可主客體包合兩個苯丙氨?；肿拥奶攸c，以葫蘆[8]脲交聯(lián)含苯丙氨酰支鏈的聚乙烯亞胺（PEI）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：可能是由于交聯(lián)前的苯丙氨酰化PEI 局部濃度較低，呈生物惰性，而葫蘆[8]脲交聯(lián)后可增大抗菌劑局部濃度，賦予上述材料強抗菌活性。在此基礎(chǔ)上，加入能與葫蘆[8]脲形成更穩(wěn)定復(fù)合物的競爭性客體分子后，苯丙氨?；疨EI 的抗菌活性隨之關(guān)閉。

最后，本文所述各類刺激響應(yīng)型抗菌劑使用的模型抗菌劑、響應(yīng)基團、開關(guān)原理、優(yōu)缺點等基本信息匯總列于表1。

表1 刺激響應(yīng)型抗菌劑分類匯總Tab.1 A summary of stimulus-responsive antibacterial agents

展望

如前所述，在低毒、低耐藥性新型抗菌劑尚缺乏的情況下，已有科研工作者嘗試將熱、磁響應(yīng)抗菌劑應(yīng)用于膠原抗菌防腐，借助膠原儲存液與人體自然溫差、外部磁場，或“自適應(yīng)”關(guān)閉膠原所含抗菌劑活性，或?qū)⒛z原所含抗菌劑富集回收，為規(guī)避膠原所含抗菌劑毒副作用、防止細菌耐藥性產(chǎn)生提供了新思路。

實際上，光、pH、主客體響應(yīng)型抗菌劑在膠原等生物質(zhì)的抗菌防腐中同樣具有應(yīng)用前景。不難想象，可將光致失活型抗菌劑負載于膠原基醫(yī)用材料，利用光照前抗菌劑抗菌功能，防止膠原在儲存、使用過程中變質(zhì)。當膠原基醫(yī)用材料被丟棄后，所含抗菌劑會按設(shè)計在紫外或可見光照射下發(fā)生降解反應(yīng)，避免活性抗菌劑在環(huán)境中累積。當然，主客體響應(yīng)型抗菌劑也可實現(xiàn)同樣功能，只要該抗菌劑與主體超分子結(jié)合會大幅降低其靶標可及性。

目前，造成刺激響應(yīng)型抗菌劑在膠原等生物質(zhì)抗菌防腐中應(yīng)用受阻的原因包括：（1）為賦予傳統(tǒng)抗菌劑刺激響應(yīng)功能，通常需要對抗菌劑分子結(jié)構(gòu)進行改造，存在合成步驟繁瑣、產(chǎn)率低、容易造成抗菌劑活性下降等問題；（2）上述化學(xué)改性是否會帶來額外的毒副作用尚不得而知；（3）不少已報道的刺激響應(yīng)抗菌劑工作機制尚不明確，前人相關(guān)解釋甚至相互矛盾，無法為膠原專用刺激響應(yīng)抗菌劑的分子設(shè)計提供理論指導(dǎo)；（4）刺激響應(yīng)抗菌劑具有“開→關(guān)”、“關(guān)→開”兩種工作模式，其中只有“開→關(guān)”模式可用于規(guī)避膠原所含抗菌劑毒副作用并防止細菌耐藥性產(chǎn)生，而大量具有“關(guān)→開”工作模式的刺激響應(yīng)型抗菌劑在膠原抗菌防腐領(lǐng)域暫時無用武之地。