ELISA法檢測(cè)花生油中黃曲霉毒素B1前處理方法的改進(jìn)研究

付瓏

摘要：目的：對(duì)國(guó)標(biāo)GB/T 5009.22-2003中第二法ELISA法測(cè)定花生油中黃曲霉毒素B1的樣品前處理進(jìn)行改良。方法：通過分別考察不同濃度的甲醇提取溶劑，分液漏斗萃取的不同振蕩力度及頻率，pH的調(diào)節(jié)對(duì)免疫反應(yīng)的影響等。結(jié)果：提出了樣品處理的最佳組合：使用60%甲醇提取液，分液漏斗萃取最優(yōu)轉(zhuǎn)速250rpm，振蕩時(shí)間15min，樣品提取物pH調(diào)節(jié)為6-8。新改進(jìn)方法下樣品加標(biāo)回收率在80～110%之間。提高了ELISA法檢測(cè)花生油黃曲霉毒素B1的效率和準(zhǔn)確度。

關(guān)鍵詞：花生油 黃曲霉毒素B1 ELISA 前處理方法 改進(jìn)

中圖分類號(hào)：R155.5+8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2014）16-0025-02

Abstract：objective：The ELISA detection method of Aflatoxin B1 in peanut oil should be optimized in national standard（GB/T 5009.22--2003）.Method：Respectively inspect different concentration of methanol extraction solvent，and extract different oscillation intensity and frequency with separating funnel，as well as study the effect of pH adjustment on the immune response.Result：Abstract the best combination of sample processing by using 60% methanol extract，the optional way of separating funnel extraction speech is 250rpm，the oscillation time is 15min，pH adjustment of sample extracts is 6—8.The sample standard addition recovery rate is between 80% and 110% with the new improved method.It helps improve the ELISAs efficiency and accuracy of detecting Aflatoxin B1 in peanut oil.

Key Words：peanut oil；aflatoxin B1；ELISA；pretreatment method；improvement

黃曲霉毒素（Alfatoxin，AFT）主要是黃曲霉和寄生曲菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，具一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，二氫呋喃香豆素的衍生物。主要包括B1、B2、G1、G2、M1、M2等六種成分[1]。是一種劇毒物質(zhì)。1993年被衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)定為1類致癌物，其中以黃曲霉毒素B1最為多見，其毒性和致癌性也最強(qiáng)[2]。植物油中的黃曲霉毒素B1是食品中真菌毒素殘留的日常檢測(cè)指標(biāo)[3]。我國(guó)規(guī)定AFB1在花生油的最大限量標(biāo)準(zhǔn)為20μg/kg。目前常見的方法主要有薄層層析法（TLC）、液相色譜法（HPLC）和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[4]。TLC和HPLC法存在樣品處理復(fù)雜，分析時(shí)間長(zhǎng)，設(shè)備昂貴等缺點(diǎn)，ELISA法因靈敏、簡(jiǎn)便、快速、成本低廉，適合大批量檢測(cè)而被廣泛應(yīng)用。AFB1檢測(cè)的準(zhǔn)確度與樣品是否完全提取有關(guān)。如何提高樣品的提取率，本文從樣品提取溶劑比例、萃取的振蕩力度及頻率、pH的控制等因素進(jìn)行改進(jìn)研究，減少人工操作，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

酶標(biāo)儀（上海三科儀器有限公司）、分液漏斗振蕩器（日本ATAGO）、ELISH快速測(cè)試盒（山西德豐信成生物科技有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、分析天平（德國(guó)SARTOIUS）、50～300μL八道移液器（Thermo Scientific）。甲醇（天津永大化學(xué)試劑有限公司）、石油醚（廣州化學(xué)試劑廠）均為分析純。

1.2 樣品采集

實(shí)驗(yàn)用10批次花生油，購自市場(chǎng)糧油銷售點(diǎn)。

1.3 樣品提取

（1）國(guó)標(biāo)方法。參照國(guó)標(biāo)（GB/T 5009.22-2003）中第二法的樣品處理方法，制成樣品提取物。

（2）對(duì)國(guó)標(biāo)方法加以改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取5g花生油于25mL燒杯中，用20mL石油醚分次將試樣轉(zhuǎn)移至125mL分液漏斗中，準(zhǔn)確加入25mL提取液，加塞，振搖10秒后排氣，再加塞，防止液漏，移到一定轉(zhuǎn)速的分液漏斗振蕩器振蕩一定時(shí)間，靜置分層，放出下層提取液，此液即為樣品提取物。

1.4 ELISA檢測(cè)步驟

（1）從冰箱中取出黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫試劑盒，平衡至室溫。把濃縮洗滌液按3：57比例稀釋，配成洗滌工作液，并清洗抗體板條2次，拍干后備用。

（2）選擇數(shù)孔分別加入50μL黃曲霉毒素B1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液ng/mL（0、0.25、0.5、1、2.5），其余孔內(nèi)各加入 50μL待測(cè)樣品提取液，隨即在各孔分別加入50mLAFB1抗體和50μL酶結(jié)合物，搖勻，37℃避光溫育30min。將溫育后的抗體板取出，棄去未反應(yīng)抗原溶液，用洗滌液洗滌4次。拍下后各孔分別加入100μL顯色劑。37℃顯色5min。往各孔中分別加入50μL終止液，立即用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中的AFB1含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 各種提取溶劑的配比比例對(duì)AFB1提取效果的影響

將5μg/kg、20μg/kg、50μg/kg三種濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品分別添加于花生油樣品中，采用上述表1的配比設(shè)計(jì)進(jìn)行提取處理，按1.3.2、1.4試驗(yàn)步驟，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定AFB1的含量，每個(gè)濃度重復(fù)三次測(cè)定，同時(shí)做樣品空白。計(jì)算各個(gè)配比的加標(biāo)回收率。

從表2中可以說明，對(duì)于不同污染程度的花生油樣品，各溶劑比例對(duì)回收率存在很大差異。對(duì)于低濃度的樣品（加標(biāo)5μg/kg），50%甲醇水回收率較好；其他回收率超過100%，容易造成假陽性；對(duì)于中度污染樣品（加標(biāo)20μg/kg），60%甲醇水回收率接近100%，比較理想；對(duì)于重度污染的樣品（加標(biāo)50μg/kg），80%甲醇水回收率最高。由于花生油的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量要求為≤20μg/kg，所以FLASH作為大量樣品篩查的方法，采用甲醇/水（60：40）作為樣品提取溶劑效果最佳。

2.2 分液漏斗振蕩器轉(zhuǎn)速對(duì)結(jié)果的影響

花生油樣品處理固定振蕩時(shí)間為15min，研究振蕩速度對(duì)AFB1提取效果的影響，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到250rpm后，AFB1測(cè)定值達(dá)到穩(wěn)定，轉(zhuǎn)速增大，測(cè)定結(jié)果變化不大。所以本優(yōu)化方法選定分液漏斗振蕩器轉(zhuǎn)速為250rpm。

2.3 振蕩時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響

花生油樣品處理固定振蕩器轉(zhuǎn)速為250rpm，研究振蕩時(shí)間對(duì)AFB1提取效果的影響，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，AFB1與振蕩時(shí)間成正比，當(dāng)振蕩時(shí)間達(dá)到15min時(shí)，AFB1測(cè)定值達(dá)到最大值。所以本優(yōu)化方法選定振蕩時(shí)間為15min。

2.4 pH值對(duì)結(jié)果的影響

當(dāng)pH<4時(shí)，A1/A0較低，結(jié)果呈假陽性；當(dāng)pH>8時(shí)，結(jié)果呈陰性。由于60%甲醇提取液的pH值為4～6之間，故需要用NaoH溶液調(diào)節(jié)pH為6～8，使酶活性在正常范圍內(nèi)，再進(jìn)行提取和測(cè)定。

2.5 優(yōu)化方法與國(guó)標(biāo)方法（GB/T 5009.22-2003中第二法）的比較

選取10份花生油樣品，以5μg/kg濃度加標(biāo)，通過兩種前處理方法，其回收率見表3。優(yōu)化方法的回收率比國(guó)標(biāo)法高。優(yōu)化方法減少了人工操作，使用分液漏斗振蕩器固定了轉(zhuǎn)速，振蕩時(shí)間，避免人為因素帶來的誤差，而國(guó)標(biāo)法處理步驟繁瑣，并且其凝結(jié)物不易完全溶解，粘附于蒸發(fā)皿上，降低回收率。因此，當(dāng)前優(yōu)化的前處理方法具有較好的實(shí)際操作與參考意義。

3 結(jié)語

本文探討了ELISA法最佳提取黃曲霉毒素B1參數(shù)，分別考察了不同濃度的甲醇提取溶劑，分液漏斗萃取的不同振蕩力度及頻率，pH的調(diào)整對(duì)免疫反應(yīng)的影響等。對(duì)國(guó)標(biāo)GB/T 5009.22-2003中第二法ELISA測(cè)定花生油中黃曲霉毒素B1的樣品前處理進(jìn)行改良，提出了樣品處理的最佳組合：使用60%甲醇提取液，分液漏斗萃取最優(yōu)轉(zhuǎn)速250rpm，振蕩時(shí)間15min，樣品提取物pH調(diào)節(jié)為6-8。本方法與國(guó)標(biāo)比較，統(tǒng)一了操作者的振搖力度與頻率，減少了人為操作，避免人為因素帶來的誤差，縮短了前處理時(shí)間。新改進(jìn)方法下樣品加標(biāo)回收率在80～110%之間。本實(shí)驗(yàn)的意義在于提高了ELISA法檢測(cè)花生油黃曲霉毒素B1的效率和準(zhǔn)確度。

參考文獻(xiàn)

[1]陳淑潤(rùn).ELISA法檢測(cè)大米、食用油中黃曲霉毒素B1前處理方法的研究[J].福建輕紡，2006，7：30-33.

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[4]陳曉玲，戴曉瑛，羅建平.酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)食用油中黃曲霉毒素B1[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2000，10（1）：59-60.