TaNAC14轉基因小麥外源目標基因拷貝數及遺傳穩(wěn)定性分析

張立堅，池 青，杜琳穎，郭利建，李玉蓮，劉香利,3，馬 猛,3，趙惠賢,3

(1.西北農林科技大學生命科學學院，陜西楊凌 712100； 2.山東省農業(yè)科學院作物研究所，山東濟南 250100；3.西北農林科技大學旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

小麥(Triticumaestivum)作為世界三大主要糧食作物之一，其產量直接關系著世界糧食安全。1992年Vasil等首次獲得轉基因小麥[1]，此后許多小麥研究工作者嘗試通過轉基因技術進行小麥遺傳育種改良[2-3]。目前小麥遺傳轉化主要采用基因槍法和農桿菌介導法[3-4]，基因槍法轉化效率不高，通常因為外源基因會出現多位點插入整合，導致外源基因沉默[5]；然而農桿菌介導的遺傳轉化，轉基因植株外源基因插入整合位點和轉基因拷貝數較少[2]。外源基因以單拷貝插入整合到受體植物中時，其表達水平較高且遺傳穩(wěn)定性較好；而外源基因以多拷貝插入整合到受體植物時，其表達水平很低甚至會導致基因沉默，而且目標基因的遺傳穩(wěn)定性也較差[6-7]。因此，在小麥轉基因研究中，進行T0代轉基因再生植株外源基因拷貝數檢測，篩選獲得單拷貝轉基因植株是非常關鍵的環(huán)節(jié)，該步驟為后續(xù)篩選獲得遺傳穩(wěn)定且高效表達的轉基因株系奠定了基礎[8]。

檢測轉基因植物外源基因拷貝數最經典的方法是Southern印跡雜交(Southern blot)[9]，該方法準確度較高，但也存在DNA樣品用量大、操作步驟繁瑣、部分檢測步驟還需要放射性同位素等缺陷[10]。針對這些不足，近年來研究者建立了樣品用量少、簡單、快速、靈敏度高和高通量的實時定量PCR(qRCR)方法來檢測轉基因植物中外源基因的拷貝數[11]。Weng等[12]同時用Southern blot和TaqMan qPCR兩種方法對轉基因油菜(Brassicanapus)進行外源基因拷貝數檢測，結果表明用TaqMan qPCR方法測定的拷貝數和用Southern blot測定得到的拷貝數是一致的，從而證明用TaqMan qPCR檢測轉基因植物外源基因拷貝數的方法體系是準確可靠的。劉振華等[13]以外源脂氧合酶(LOX)抑制基因(Loxi)的轉基因小麥株系為材料，用TaqMan qPCR方法快速準確地測定了其外源基因拷貝數，同時分析了轉基因小麥株系和非轉基因對照的種子LOX活性，結果發(fā)現外源Loxi的拷貝數與種子LOX活性呈負相關。

轉錄因子是真核生物細胞內一類具有轉錄調控功能的蛋白質，它可以通過與特定基因啟動子區(qū)特定的順式作用元件結合，調控靶標基因在生物體內的時空表達[14]。NAC轉錄因子是一類植物特異的轉錄因子家族，在植物生長發(fā)育過程中起著重要的作用[15]。Mohammed等[16]研究發(fā)現擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)分別有154個和117個NAC轉錄因子成員，這些NAC轉錄因子廣泛參與調控植物生長發(fā)育和響應逆境脅迫。在擬南芥NAC轉錄因子家族成員中，CUC1、CUC2和CUC3等基因均參與分生組織和器官邊界的形成[17]；根尖和側根中高表達的NAC1基因受吲哚乙酸(IAA)的誘導，能促進側根的形成[18]；擬南芥ANAC019、ANAC055和ANAC072基因的誘導表達，可以顯著提高植株的抗旱能力[19-21]。Jiang等[22]發(fā)現在水稻中過表達OsNAC2，可以顯著影響水稻的株型和產量。

基于全基因組序列信息預測，Guerin等[23]發(fā)現小麥NAC轉錄因子家族共包含488個成員，在小麥響應逆境脅迫等生物學過程中發(fā)揮著重要的作用。Xia等[24]證明TaNAC8對小麥條銹病病原感染和非生物脅迫都有響應。Uauy等[25]發(fā)現小麥中調控衰老的NAC轉錄因子可以改善籽粒中蛋白質、鋅和鐵的含量。Chen等[26]發(fā)現轉基因過表達TaRNAC1能促使小麥根長和生物量增加，以及抗旱性提高。本課題組克隆得到TaNAC14基因，將TaNAC14與TaRNAC1這兩個基因進行序列比對，并在最新小麥基因組序列IWGSC Ref.v1.0[27]進行搜索，結果發(fā)現TaNAC14(TraesCS2B02G343600)與TaRNAC1(TraesCS2D02G324700)高度相似，達97.65%，TaNAC14位于小麥B基因組上，TaRNAC1位于小麥D基因組上，二者是來自不同亞基因組的旁系同源基因。小麥miRNA及降解組研究發(fā)現TaNAC14是miRNA164的調控靶標之一，表達譜分析顯示TaNAC14/TaRNAC1在小麥籽粒發(fā)育時期表達水平較高(文章尚未發(fā)表)。但是，目前TaNAC14/TaRNAC1在小麥籽粒生長發(fā)育中的生物學功能尚不清楚。

為了揭示TaNAC14基因在小麥籽粒生長發(fā)育中的生物學功能，本課題組采用農桿菌介導法獲得了轉TaNAC14基因小麥。本研究主要對轉基因小麥中插入整合外源基因TaNAC14的拷貝數進行測定，同時對轉基因小麥中外源基因的遺傳穩(wěn)定性和表達水平進行分析，旨在篩選出單拷貝、能夠穩(wěn)定遺傳并且能高水平表達的TaNAC14轉基因小麥株系，為后續(xù)TaNAC14的功能研究奠定基礎，為小麥育種提供新的遺傳穩(wěn)定的種質材料。

1 材料與方法

1.1 材料與載體

植物材料為春性小麥JW1(野生型，轉基因受體材料)和14個T0代轉基因小麥再生植株(通過農桿菌介導的pCAMBIA3301-P35S-TaNAC14遺傳轉化而來)，由濟南邦迪生物科技有限公司提供。植物表達載體pCAMBIA3301-P35S-TaNAC14由本實驗室構建，其T-DNA區(qū)結構如圖1所示。

LB：左邊界；RB：右邊界；35S T：35S終止子；Bar：篩選標記基因，通過編碼膦絲菌素乙酰轉移酶來增強植株對BASTA的耐受性；Camv35S：花椰菜花葉病毒35S啟動子；HisTag6×：6×His標簽；Nos T：Nos基因終止子。

1.2 儀器與試劑

定量儀器為CFX96實時定量PCR Detection System(BIO-RAD)；2 × Es Taq MasterMix購自康維世紀生物有限公司；Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)(RR390A)、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)(RR820Q)和反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)(RR036A)均購自大連寶生物有限公司；RNA提取試劑盒(RP3202)購自北京百泰科生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥基因組DNA的提取

采用CTAB法提取三葉期小麥葉片基因組DNA[28]。DNA樣品的濃度利用電泳檢測和分光光度計確定，通過比較波長230 nm吸光值(OD230)、260 nm吸光值(OD260)和280 nm吸光值(OD280)的比值以判斷DNA樣品的純度。

1.3.2 小麥總RNA的提取及cDNA 的合成

取9個T1代陽性植株和野生型JW1的三葉期植株葉片，用RNA提取試劑盒提取總RNA，用反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA。反轉錄條件為：25 ℃退火5 min，42 ℃延伸30 min，70 ℃反轉錄酶失活15 min，獲得 cDNA。

1.3.3 T0代轉基因小麥再生植株的鑒定

本研究根據前期研究的方法[29]，用100 mg·L-1的BASTA溶液均勻涂抹于三葉一心期的野生型小麥JW1和14株T0代轉基因小麥的第一片完全展開葉片上，涂抹面積為整個葉片的1/3，于溫室18 ℃培養(yǎng)7 d后觀察植株葉片表型。

因為轉基因小麥植株中插入序列含有TaNAC14+Nos(終止子)序列，而TaNAC14來自于小麥本身，所以本研究以目標基因TaNAC14之后的Nos序列為PCR擴增的目標序列，對T0代轉基因植株進行PCR鑒定。用Primer 5.0設計序列特異引物，進行序列特異PCR擴增檢測轉基因小麥再生植株中的陽性植株，引物由西安擎科澤西生物科技有限責任公司合成(表1)。目的片段長度為192 bp。PCR反應體系為：2×Es Taq MasterMix 0.2 μL，上游引物Nos-F(10 μmol·L-1)0.5 μL，下游引物Nos-R(10 μmol·L-1)0.5 μL，模板(50 ng·μL-1)2 μL，ddH2O補至20 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火30 s， 72 ℃延伸15 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，核酸染料染色，用凝膠成像儀觀察。比較BASTA涂抹和PCR結果，統(tǒng)計T0代轉基因小麥陽性植株和陰性植株的數量。

表1 TaNAC14基因的探針引物和定量引物信息

1.3.4 TaqMan qPCR擴增

以小麥內源控制籽粒硬度的主效單拷貝基因Pinb(Puroindolineb，GenBank登錄號：LOC543301)為內參基因，以轉基因小麥植株中目標基因TaNAC14之后的Nos序列為外源目標序列進行TaqMan qPCR擴增。內參基因和外源目標序列的探針引物設計通過IDT(Integrated DNA Technologies)網站中Primer Quest Tool設計(http://sg.idtdna.com/Primerquest/Home/Index)，由Invitrogen公司(上海)合成(表1)；普通引物采用Primer 5.0進行設計分析，由西安擎科澤西生物科技有限責任公司合成(表1)。PCR反應體系為：2 × Premix Ex Taq 12.5 μL，模板(50 ng·μL-1)1 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，TaqMan探針(5 μmol·L-1)1.5 μL，ddH2O補至25 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s， 60 ℃延伸20 s，40個循環(huán)。每個樣品設置3次生物學重復，每個重復樣品進行3次技術重復。

1.3.5 內參基因Pinb和外源序列Nos擴增標準曲線的建立

以野生型小麥JW1為陰性對照，ddH2O為空白對照，以5倍梯度稀釋的轉基因植株TaNAC14-3的基因組DNA為模板進行qPCR，設置3個重復，獲得不同濃度模板的Ct值，根據不同濃度模板對應的Ct值與其濃度對數值LogC0(C0為qPCR的起始濃度) 之間的關系分別建立Pinb和Nos的擴增標準曲線。

1.3.6 T0代轉基因小麥再生植株中外源序列Nos拷貝數的檢測

轉基因小麥外源目標基因拷貝數的測定參考Weng等[12]的方法。

拷貝數計算公式：

X0/R0=10[(Ctx-Ix)/Sx-(CtR-IR)/SR]，其中X0和R0分別為外源序列Nos和內參基因Pinb的拷貝數，CtX和CtR分別為外源序列Nos和內參基因Pinb的PCR擴增熒光量達到閾值的循環(huán)數，IX與IR分別為外源序列Nos和Pinb標準曲線的截距，SX和SR分別為外源序列Nos和內參基因Pinb標準曲線的斜率。本研究采用的內參基因Pinb為小麥中的單拷貝純合基因，因此公式中的R0為2。

1.3.7 單拷貝轉基因小麥再生植株T0:1代株系轉基因的遺傳穩(wěn)定性分析

將上述鑒定的T0代單拷貝轉基因小麥植株收獲的種子在溫室中加代種植，獲得T1代轉基因小麥株系。將100 mg·L-1的BASTA溶液均勻涂抹于三葉一心期的野生型小麥和T1代轉基因小麥植株完全展開葉片，鑒定和統(tǒng)計T1代轉基因陽性和陰性植株數目，分析轉基因小麥T0:1代株系轉基因的遺傳情況。

1.3.8 T1代轉基因小麥株系目的基因表達水平測定

以9株T1代陽性植株和野生型JW1的cDNA為模板，通過qPCR來檢測目標基因的表達水平，以小麥β-actin(GenBank登錄號：MF405765.1)基因作為內參進行歸一化處理。qPCR以野生型小麥JW1為陰性對照，ddH2O作為空白對照，每個樣品設置3個獨立的生物學重復。檢測引物NAC14-F、NAC14-R、ACTIN-F和ACTIN-R采用Primer 5.0進行設計，由西安擎科澤西生物科技有限責任公司合成(表1)。PCR反應體系：2×TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補至20 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，45個循環(huán)。每管PCR擴增反應的特異性由儀器記錄的溶解曲線證實。采集分析各樣品的Ct值，各樣品中目標基因相對表達水平按照改良的2-△△Ct方法[30]計算。用EXCEL軟件進行數據統(tǒng)計和分析，用SPSS軟件進行差異顯著性分析[31]。

2 結果與分析

2.1 T0代轉基因小麥再生植株鑒定結果

用100 mg·L-1的BASTA溶液均勻涂抹于三葉一心期的野生型小麥JW1和14個轉基因小麥T0代再生植株的第一片完全展開葉片，7 d后觀察葉片表型。野生型小麥JW1和部分轉基因再生植株的表型如圖2所示，野生型小麥JW1涂抹BASTA溶液后葉片發(fā)黃枯萎，轉基因再生植株中有5株(TaNAC14-2、TaNAC14-6、TaNAC14-7、TaNAC14-8和TaNAC14-11)表型與野生型JW1相同，即涂抹葉片發(fā)黃枯萎，表明它們?yōu)檗D基因陰性植株；其他9株再生植株涂抹BASTA溶液后葉片無明顯變化，表明這些植株為轉基因陽性植株。

JW1：野生型；TaNAC14-2：轉基因陰性； TaNAC14-3：轉基因陽性；JW1和TaNAC14-2葉片變黃枯萎；TaNAC14-3葉片無明顯變化。

進一步以野生型JW1和14株T0代轉基因再生植株的基因組DNA為模板，進行目標序列特異PCR擴增，擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果顯示陽性對照pCAMBIA3301質粒和上述9株轉基因陽性植株均能擴增出大小為192 bp的目的條帶，而空白對照(水)、陰性對照野生型小麥JW1和5株轉基因陰性植株均沒有相應的擴增條帶(圖3)。

M：Marker DL2000；H2O：ddH2O；N：陰性對照JW1；P：陽性對照pCAMBIA3301質粒；1～14：轉基因植株TaNAC14-1～TaNAC14-14。

總之，BASTA溶液涂抹和目標序列特異PCR擴增鑒定結果完全一致，14個轉TaNAC14基因小麥的T0代再生植株中有9個為轉基因陽性株系。

2.2 T0代轉基因小麥再生植株外源序列拷貝數檢測結果

2.2.1 TaqMan qPCR擴增及標準曲線的建立

以轉基因植株TaNAC14-3基因組DNA的5倍系列稀釋液作為模板，分別用內參基因Pihb和目標序列Nos的特異引物和探針引物進行qPCR擴增。

以LogC0為X軸，C0相對應的Ct值為Y軸，分別建立Pinb和Nos的標準曲線(圖4A和4B)。由圖4可以看出，內參基因Pinb擴增標準曲線的方程為y=-3.139x+35.142，R2= 0.998，縱軸截距IR=35.142，斜率SR= -3.139，PCR擴增效率為107.9%(圖4A)。外源序列Nos擴增標準曲線方程為y=-3.109x+31.705，R2= 0.999，縱軸截距IX=31.705，斜率SX= -3.109，PCR擴增效率為108.9%(圖4B)。這兩個擴增標準曲線的相關系數分別為 0.998和0.999，都接近于1，表明得到的標準曲線能夠用于檢測T0代轉基因小麥植株目標基因拷貝數。

圖4 內參基因Pinb(A)和外源序列Nos(B)的標準曲線

2.2.2 T0代轉基因小麥植株外源序列的拷貝數

以9株T0代轉基因小麥陽性植株基因組DNA為模板，分別用內參基因Pinb和外源序列Nos的特異引物和探針進行TaqMan qPCR擴增，得到的外源序列和內參基因擴增的Ct值見表2。各轉基因小麥植株的外源序列拷貝數X0計算結果如表2所示。由表2可以看出，9個T0代轉基因小麥陽性株系中有5個為轉基因單拷貝，4個為雙拷貝。

表2 T0代轉基因小麥植株外源序列拷貝數

2.3 外源基因單拷貝插入整合的小麥T0:1株系轉基因的遺傳穩(wěn)定性

由于轉基因植株的種子萌發(fā)率低且植株生長狀況不佳，僅獲得2個T0:1株系TaNAC14-3(7株)和TaNAC14-9(4株)。采用BASTA涂抹方法鑒定這2個T0:1代小麥株系所有T1代植株轉基因陽性與陰性植株的數量(表3)，結果表明，TaNAC14-3的7株T1代轉基因植株中有5株(TaNAC14-3-1、TaNAC14-3-2、TaNAC14-3-3、TaNAC14-3-5、TaNAC14-3-6)為陽性，TaNAC14-9的4株T1代轉基因植株中有2株(TaNAC14-9-1、TaNAC14-9-2)為陽性。這表明本研究得到的外源目標基因TaNAC14是可遺傳的。

表3 T0:1轉基因小麥株系目標基因的遺傳穩(wěn)定性分析

2.4 T1代轉基因小麥植株目標基因的表達量

用RT-qPCR方法，分別對上述得到的7個T1代轉基因陽性植株和野生型JW1葉片目標基因的表達水平進行測定。結果(表4)表明，與對照JW1相比，各轉基因植株的目標基因TaNAC14表達量均極顯著增加，并且2個株系的每個植株間的表達水平存在一定的差異。

表4 轉基因小麥植株目標基因 TaNAC14的表達水平

3 討 論

前人研究報道轉基因表達載體上Nos終止子序列的檢測結果可被用作判斷轉基因作物的主要依據[32-33]。因此，通過檢測Nos終止子序列的拷貝數來確定T0代轉基因小麥植株中插入整合的外源基因拷貝數是可信的。在小麥遺傳改良過程中，農桿菌介導的遺傳轉化法獲得的轉基因植株，外源目標基因常以低拷貝隨機插入整合到受體植株中，這有利于外源目標基因的穩(wěn)定遺傳和表達，為轉基因植株的功能研究和育種應用提供了條件[34]。本研究利用TaNAC14基因通過農桿菌介導法對小麥進行遺傳轉化，通過篩選標記基因和目標序列特異PCR方法鑒定獲得了9株T0代轉基因陽性植株，其中5株為單拷貝轉基因植株，4株為雙拷貝，單拷貝插入整合的比率接近 55.6%。

轉基因功能研究或轉基因作物育種的前提是外源基因能夠插入整合至受體基因組中，而且能高水平表達和穩(wěn)定遺傳。本研究對獲得的單拷貝插入整合的T0代小麥轉基因過表達植株在溫室進行加代繁殖，獲得了T1代轉基因小麥過表達株系。在此基礎上，本研究對T0:1代TaNAC14轉基因小麥株系的目標基因遺傳穩(wěn)定性進行分析，結果顯示T0代轉基因植株TaNAC14-3和TaNAC14-9的目標基因均遺傳至T1代；進一步用RT-qPCR對T1代轉基因小麥植株中目標基因TaNAC14的表達水平進行檢測，結果顯示，轉基因植株TaNAC14的表達量均極顯著高于野生型。這說明本研究獲得了目標基因TaNAC14能夠穩(wěn)定遺傳而且高水平表達的轉基因小麥株系，這為后續(xù)TaNAC14基因的生物功能研究提供了基礎材料。本研究計劃后期對TaNAC14的轉基因小麥株系繼續(xù)加代繁殖和篩選鑒定，以期獲得純合的轉基因小麥株系，進而研究TaNAC14基因對小麥生長發(fā)育和產量性狀的影響。

4 結 論

本研究采用BASTA涂抹和PCR檢測相結合的方法，從14株T0代TaNAC14轉基因再生植株中鑒定出9株陽性植株；用TaqMan qPCR方法檢測了9株T0代轉基因陽性小麥植株外源基因的拷貝數，得到5株單拷貝轉基因植株。對這些單拷貝轉基因植株的T0:1株系目標基因的遺傳情況進行分析，表明TaNAC14是可遺傳的。對T1代轉基因小麥株系目標基因TaNAC14表達水平進行測定，結果表明，轉基因小麥中TaNAC14的表達水平與野生型相比，顯著增加。本研究獲得的可遺傳且高水平表達的TaNAC14轉基因小麥株系為后續(xù)該目標基因的功能研究奠定了重要基礎。