SAHA預(yù)處理提高初進(jìn)高原致死性失血性休克大鼠早期生存率的研究

張彥圓 耿智隆 徐鵬 高曉華

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.08.014

作者單位：730030 蘭州，蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院麻醉科

通信作者：耿智隆， Email：zlgch@hotmail.com

高原環(huán)境與平原有著明顯的差異，初進(jìn)高原，機(jī)體尚未適應(yīng)高原低氣壓、低氧且干燥寒冷的急劇變化，如果發(fā)生失血性休克，全身反應(yīng)十分嚴(yán)重，病情進(jìn)展迅速，救治極為困難，加之高原交通運(yùn)輸不便，難以及時(shí)提供復(fù)蘇液體，常常延誤黃金救治期，傷員很難度過最初的60 min，超過120 min和180 min更加困難。近年來，休克的藥物治療由于其臟器保護(hù)作用和便于運(yùn)輸攜帶的突出特點(diǎn)，正在受到越來越多的關(guān)注，其中組蛋白脫乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitors，HDACI）是一類抑制組蛋白脫乙酰化酶活性的藥物，能提高DNA轉(zhuǎn)錄水平，引起一系列亞細(xì)胞分子水平改變，具有非常廣泛的生物學(xué)作用，可用于癲癇、惡性腫瘤和神經(jīng)退行性變等疾病的治療^[1-2]，研究發(fā)現(xiàn)其對失血性休克動物有救治作用^[3-5]， HDACI中羥肟酸鹽類的SAHA對平原地區(qū)致死性失血性休克大鼠的救治效果確切[3， 6-7]，但尚未見針對高原地區(qū)的研究及失血前預(yù)處理的研究。本研究通過建立初進(jìn)高原致死性失血性休克大鼠模型，探討SAHA預(yù)處理對其早期生存率是否有影響，以期對高原急性失血性休克患者的藥物救治研究有一定推動作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

健康成年雄性清潔級SD大鼠36只，體質(zhì)量（260±20）g，均由甘肅省中醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供（海拔1520 m）。大鼠分批運(yùn)往實(shí)驗(yàn)地（蘭州榆中馬銜山，海拔3780 m），每批動物于5 d內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為3組（n=12）：假手術(shù)組（Ⅰ組），NS預(yù)處理組（Ⅱ組），SAHA預(yù)處理組（Ⅲ組）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備

SAHA（德國默克制藥有限公司）；異氟醚（英國雅培制藥有限公司）。ALC-MPA2000多功能生物信號分析系統(tǒng)、ALC-HTP實(shí)驗(yàn)動物恒溫系統(tǒng)、 ALC-IP可編程注射泵均為上海奧爾科特生物科技有限公司產(chǎn)品；全自動血?dú)夥治鰞x（GEM公司，premier 3000）。

1.3 致死性失血性休克大鼠模型建立及給藥方法

大鼠實(shí)驗(yàn)前不禁食水，使用3%異氟醚-氧氣誘導(dǎo)麻醉，0.5%～1%異氟醚-空氣維持麻醉，仰臥位固定，0.75%布比卡因局部浸潤麻醉。分離并暴露雙側(cè)股動脈及右側(cè)股靜脈，分別置入PE50管，經(jīng)右側(cè)股動脈管連接多通道生理檢測儀，持續(xù)監(jiān)測平均動脈壓（MAP）及心率。穩(wěn)定后建立初進(jìn)高原大鼠致死性失血性休克模型：40%總血容量（total blood volume，TBV）在10 min內(nèi)由左側(cè)股動脈放出，隨后50 min經(jīng)右側(cè)股靜脈放出15%TBV，分別模仿臨床中患者受傷后即刻出現(xiàn)的快速失血及簡單救治后慢性出血的過程，失血過程通過可編程注射泵實(shí)現(xiàn)。TBV計(jì)算按下列公式： TBV（mL）=體質(zhì)量（g）×0.06（mL/g）+0.77[3， 8- 9]。于失血結(jié)束60 min后撤PE50管，結(jié)扎血管、縫合傷口，歸籠觀察180 min。實(shí)驗(yàn)過程中通過動物恒溫系統(tǒng)維持大鼠直腸溫度于36.5～37.5 ℃。

Ⅰ組行手術(shù)，不給予失血處理；Ⅱ、Ⅲ組手術(shù)后制作初進(jìn)高原大鼠致死性失血性休克模型。Ⅱ組于實(shí)驗(yàn)前24 h和失血前兩次經(jīng)皮下給予0.25 mL NS預(yù)處理，Ⅲ組于實(shí)驗(yàn)前24 h和失血前兩次經(jīng)皮下給予溶于0.25 mL NS的SAHA（7.5 mg/kg）溶液預(yù)處理[3， 10-11]。

1.4取材及指標(biāo)測定

1.4.1 MAP監(jiān)測記錄

持續(xù)監(jiān)測大鼠MAP，分別記錄失血前，失血結(jié)束時(shí)、失血后15 min、失血后30 min、失血后45 min和失血后60 min MAP值。

1.4.2 血?dú)夥治?/p>

分別在失血前、失血結(jié)束時(shí)和失血后60 min，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)取動脈血行血?dú)夥治?，檢測大鼠動脈血pH值、PaCO₂、PaO₂、BE值和Lac濃度，每次0.3 mL，該取血量計(jì)入失血總量中。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，使用SPSS 17.0處理系統(tǒng)，兩兩比較采用LSD單因素方差分析，生存率比較采用χ²檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)參數(shù)

三組大鼠體質(zhì)量、總血容量、失血量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.3 三組大鼠MAP在不同時(shí)間點(diǎn)變化情況

三組大鼠失血前MAP值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從失血結(jié)束時(shí)到失血結(jié)束后60 min，與Ⅰ組比較，Ⅱ、Ⅲ組MAP明顯降低（P<0.01）；失血結(jié)束后15 min到失血結(jié)束后60 min，與Ⅱ組比較，Ⅲ組MAP明顯升高（P<0.05， P<0.01）；失血結(jié)束時(shí)到失血結(jié)束后60 min，Ⅲ組自身比較，MAP無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

2.4 三組大鼠動脈血pH值、PaCO₂、PaO₂

失血前，三組大鼠動脈血pH值，PaCO₂，PaO₂間的比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失血結(jié)束時(shí)，與Ⅰ組比較，Ⅱ、Ⅲ組PaO₂顯著升高（P<0.01），pH值、PaCO₂顯著降低（P<0.01）。失血后60 min，與Ⅰ組比較，Ⅲ組PaO₂顯著升高（P<0.01），Ⅱ、Ⅲ組pH值、PaCO₂顯著降低（P<0.01）；與Ⅱ組比較，Ⅲ組pH值、PaO₂顯著升高（P<0.027， P=0.009）。見表2。

2.5 三組大鼠動脈血剩余堿（BE）、乳酸濃度（Lac）

失血前，三組大鼠動脈血BE、Lac差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失血結(jié)束時(shí)，與Ⅰ組比較，Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ組BE顯著降低、Lac顯著升高（P<0.01）；與Ⅱ比較，Ⅲ組Lac顯著降低（P=0.029）。失血后60 min，與Ⅰ組比較，Ⅱ、Ⅲ組BE顯著降低、Lac顯著升高（P<0.01）；與Ⅱ比較，Ⅲ組BE顯著升高、Lac顯著降低（P=0.024，P<0.01）。見表2。

3 討論

醫(yī)學(xué)上將海拔3000～5500 m的地區(qū)稱為高原。從海拔為1520 m大鼠養(yǎng)殖地到海拔3780 m的實(shí)驗(yàn)基地，環(huán)境氧分壓約減少22.6 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），對機(jī)體的氧供相當(dāng)于原先的84%，機(jī)體短時(shí)間內(nèi)很難適應(yīng)環(huán)境氧含量的急劇減少，因此初進(jìn)高原大鼠失血量的致死性與平原地區(qū)不同，為了明確該致死量，筆者首先進(jìn)行了40只大鼠的預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果說明，相比平原地區(qū)60%的失血量^[3]，初進(jìn)高原大鼠55%的失血量為致死量。

我國海拔3000 m以上的高原、高山地區(qū)，約占全國總面積的1/6，而在相對艱苦的高原地區(qū)，復(fù)蘇液體的運(yùn)輸及傷員后送受到條件制約，失血性休克得不到及時(shí)救治，本實(shí)驗(yàn)旨在通過SAHA預(yù)處理，幫助傷員度過傷后180 min的高死亡期，為進(jìn)一步后送救治提供時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三組大鼠體質(zhì)量、總血容量、失血量，以及失血前基礎(chǔ)MAP、動脈血pH值、PaO₂、PaCO₂、BE和Lac，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示三組大鼠失血前生理狀況無明顯區(qū)別。而使用SAHA預(yù)處理大鼠，12只中有7只生存時(shí)間均超過60 min，且其中8只存活至120 min，5只存活至180 min，與NS預(yù)處理比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明其確有提高休克早期生存率的效果。該效果可能與SAHA改變細(xì)胞的基因表達(dá)和蛋白水平，提高各臟器細(xì)胞對休克和高原低氧雙重打擊下內(nèi)環(huán)境壓力的耐受能力，改善臟器功能相關(guān)。

在最關(guān)鍵的休克急性期，即休克后60 min內(nèi)，MAP監(jiān)測結(jié)果表明，使用SAHA預(yù)處理大鼠，休克完成后MAP維持在25 mmHg左右，該結(jié)果顯著高于使用生理鹽水預(yù)處理的大鼠，提示著更加有利的血流動力學(xué)狀態(tài)和相對較好的組織灌注，該結(jié)果與同為HDACI的丙戊酸鈉（VPA）用于平原地區(qū)失血性休克后處理對血流動力學(xué)的改善作用類似^[12]，但其機(jī)理尚不明確，可能與抑制炎癥反應(yīng)和血管通透性增加引起的血容量丟失等相關(guān)。

高原致死性失血性休克后，失血和高原環(huán)境的雙重壓力造成大鼠嚴(yán)重代謝性酸中毒，動脈血PH值明顯降低，而使用SAHA預(yù)處理過的大鼠PH值降低程度較輕，考慮與其維持相對較高的MAP密切相關(guān)。酸中毒激活大鼠呼吸中樞，導(dǎo)致主動過度通氣，因此大鼠PaO₂有增高趨勢。然而，初進(jìn)高原致死性失血性休克打擊造成肺血管內(nèi)皮和肺泡上皮廣泛受損，急性肺損傷（acute lung injury， ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）普遍存在，影響著大鼠肺氧合能力，因此PaO₂升高在一定程度上受到限制。SAHA預(yù)處理過的大鼠，PaO₂比使用NS預(yù)處理的大鼠增高更為明顯，可能與SAHA保護(hù)肺細(xì)胞功能，維持肺屏障功能，減少肺炎性介質(zhì)的產(chǎn)生相關(guān)。Kochanek等^[13-15]所做HDACI休克后肺保護(hù)作用機(jī)制研究，初步探索了其肺保護(hù)的可能原理，HDACI通過減少絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號途徑的激活，抑制肺血管內(nèi)皮和肺泡上皮細(xì)胞凋亡，維持肺上皮和血管的完整，保護(hù)肺臟功能。使用SAHA預(yù)處理大鼠，是否也通過抑制肺細(xì)胞凋亡保護(hù)初進(jìn)高原失血性休克大鼠肺功能，有待后期試驗(yàn)探討。

動脈血BE和Lac是判斷休克傷員預(yù)后的重要指標(biāo)，其偏離基礎(chǔ)值越遠(yuǎn)，預(yù)后越差?？紤]到實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠PaO₂的升高趨勢，BE、Lac嚴(yán)重偏離正常值并非由于動脈血氧過低所致，因此可能與失血性休克后微循環(huán)低灌注程度相關(guān)。SAHA預(yù)處理的大鼠，MAP維持在相對較高的水平，一定程度上減輕了大鼠休克所致微循環(huán)灌注的降低趨勢，因此BE顯著高于NS預(yù)處理的大鼠，而Lac顯著低于后者， Shults等^[3]將SAHA用于失血后處理也得到過類似結(jié)論，可見失血前預(yù)處理和失血后使用類似，均有改善微循環(huán)的作用。

SAHA休克前預(yù)處理雖然體現(xiàn)出確切的救治作用，但與臨床工作距離較遠(yuǎn)，其實(shí)用性和可行性受到限制。另外，單用藥物救治雖然在交通不便的高原顯示出其攜帶方便的優(yōu)勢，但不能解決休克低血容量的根本問題。因此有必要在后期試驗(yàn)中探討SAHA在失血后使用的效果， 并進(jìn)一步研究液體和藥物救治聯(lián)合使用的價(jià)值。

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（收稿日期：2013-12-27）

（本文編輯：何小軍）

P890-893