烏司他丁對(duì)膿毒癥大鼠腦組織的保護(hù)作用

曾朝濤 張萌 周天恩 蔣龍?jiān)?/p>

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.08.013

基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金（06021323）

作者單位：510120 廣州，中山大學(xué)附屬孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科

通信作者：蔣龍?jiān)?，Email：jly@China-em.com

【摘要】目的 觀察烏司他丁對(duì)膿毒癥大鼠血腦屏障及腦細(xì)胞凋亡的影響。

訪法 清潔級(jí)雄性SD大鼠52只，隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為6組。假手術(shù)（Sham）6 h組、24 h組，每組6只；膿毒癥（CLP）及烏司他?。║TI）6 h組、24 h組，每組10只。Sham組只開(kāi)腹后關(guān)腹，CLP組及UTI組用盲腸結(jié)扎穿孔法（CLP）建立膿毒癥模型，UTI組建模后1 h股靜脈注射烏司他丁50 000 U/kg，其他組注射等容量生理鹽水。各組在建模后6 h、24 h斷腦取材，取材前進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，取材后HE染色、稱(chēng)量腦干濕質(zhì)量、伊文思藍(lán)滲透法測(cè)定血腦屏障通透性，TUNEL免疫熒光檢測(cè)腦細(xì)胞凋亡。應(yīng)用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

結(jié)果 UTI組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分低于Sham組（P<0.05），高于CLP組（P<0.05）。光鏡下CLP組大鼠神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死、水腫較UTI組明顯。CLP 24 h組大鼠血腦屏障通透性較UTI 24 h組顯著升高（P<0.05）。CLP組大鼠腦細(xì)胞凋亡數(shù)較UTI組顯著增多（P<0.05）。

結(jié)論 烏司他丁通過(guò)減輕血腦屏障損傷，抑制腦細(xì)胞凋亡，對(duì)膿毒癥大鼠腦組織起保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】膿毒癥；腦損傷；盲腸結(jié)扎穿孔；烏司他??；伊文思藍(lán)；血腦屏障；免疫熒光；凋亡

Protective effect of ulinastatin on cerebral tissue in septic rats Zeng Chaotao， Zhang Meng， Zhou Tianen， Jiang Longyuan. Emergency Department of Sun Yat-Sen Memorial Hospital Afflicted to Sun Yat-Sen University， Guangzhou 510120， China.

Corresponding author： Jiang Longyuan， Email： jly@China-em.com

【Abstract】Objective To explore the effect of Ulinastatin on blood brain barrier （BBB） and apoptosis of neural cells in septic rats. Methods Fifty-two clean level male Sprague-Dawley rats were randomly（random number table） divided into six groups： Sham groups at 6 h and 24 h， each group with six rats. Sepsis groups（CLP） and Ulinastatin treated groups （UTI） at 6 h and 24 h， each group with ten rats. In CLP and UTI groups， cecal ligation and puncture （CLP） were performed to induce sepsis. Sham group was only opened and closed abdomen. Ulinastatin （50 000 U/kg） was administered via femoral vein 1 h after CLP. The same volume of saline instead of Ulinastatin was administered in Sham and CLP groups. The neurological status was assessed by Neurological Deficit Scale Scores （NDSS） at 6 h and 24 h after CLP. Then the brain was harvested for HE staining and weighing water content. The BBB permeability was assayed by Evans Blue dye extravasations. Apoptosis of neural cells were detected by TUNEL immune fluorescence. Statistical analysis was performed with SPSS version 13.0， ANOVA was used for multiple groups comparison and t-test for paired comparison. Results TheNeurological Deficit Scale Scores of UTI group was lower than Sham group（P<0.05） but higher than that of CLP group（P<0.05）. Swelling， degeneration and edema were observed in cerebral cortex and hippocampal neurons in CLP group through light microscope， and were more serious than those in UTI group. Compared with UTI 24 h group， BBB permeability of CLP 24 h group significantly rose（P<0.05）. The number of apoptosis of neural cells increased more in CLP group than it did in UTI group （P<0.05）. Conclusions Ulinastatin could protect the cerebral tissue in septic rats by alleviating the damage of BBB and reducing the apoptosis of neural cells.

【Key words】Sepsis； Cerebral injury； Cecal ligation and puncture； Ulinastatin； Evans blue； Blood brain barrier； Immune fluorescence； Apoptosis

膿毒癥腦病是膿毒癥的常見(jiàn)并發(fā)癥，其嚴(yán)重程度與患者的病死率正相關(guān)^[1]。目前并無(wú)特殊針對(duì)膿毒癥腦病的治療措施。烏司他丁是從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來(lái)的一種蛋白酶抑制劑，具有穩(wěn)定溶酶體膜，抑制溶酶體酶釋放，清除氧自由基及抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用，研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁對(duì)膿毒癥多器官有保護(hù)作用^[2-4]，但對(duì)腦組織影響的研究較少。本文試圖探討烏司他丁對(duì)膿毒癥大鼠腦組織是否有保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與模型制備

動(dòng)物模型在中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成，切片染色在中山大學(xué)病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠52只，體質(zhì)量200～250 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。用數(shù)字表法隨機(jī)分為6組，假手術(shù)（Sham） 6 h、24 h組，每組6只；膿毒癥組（CLP） 6 h、24 h組及烏司他?。║TI）6 h、24 h組，每組10只。在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下適應(yīng)1周，術(shù)前自由進(jìn)食進(jìn)水。大鼠稱(chēng)質(zhì)量后二氧化碳誘導(dǎo)麻醉，10%水合氯醛3.0 mL/kg腹腔麻醉，備皮，固定大鼠，0.2%碘伏消毒皮膚，沿腹白線作長(zhǎng)約2～3 cm切口，在左下腹找到盲腸，提拉出盲腸，取中點(diǎn)位置，4號(hào)絲線穿過(guò)盲腸血管弓內(nèi)結(jié)扎盲腸。18號(hào)粗針頭盲腸結(jié)扎段貫穿2孔，兩孔間相距約1～1.5 cm，各穿1條2 mm寬橡皮條引流、將盲腸回納腹腔，縫合腹壁。術(shù)后鈍性分離左側(cè)股靜脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，眼科剪剪出一側(cè)口，置入肝素化的23號(hào)聚乙烯管，深度約3～5 cm，回抽見(jiàn)血后結(jié)扎近心端。假手術(shù)組只開(kāi)腹后關(guān)腹，其他操作均類(lèi)同。術(shù)后1 h，UTI組股靜脈注射烏司他丁50 000 U/kg，Sham及CLP組注射等劑量生理鹽水。術(shù)后大鼠置于籠內(nèi)自由進(jìn)食水，術(shù)后6 h成模，成模標(biāo)準(zhǔn)包括一般狀態(tài)、肛溫、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、存活率，參見(jiàn)文獻(xiàn)[5]。各組6 h成活率100%，24 h CLP組存活率85%，其他兩組存活率100%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 取材及HE染色 各組按6 h、24 h時(shí)間點(diǎn)取材，取材前進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。10%水合氯醛3.0 mL/kg麻醉后，頸動(dòng)脈置管。剪開(kāi)上腔靜脈，4%多聚甲醛50 mL頸動(dòng)脈灌注15～20 min，斷頭開(kāi)顱取腦，4%多聚甲醛4 ℃固定24 h以上。石蠟包埋、切片、HE染色。

1.2.2 腦干濕重及伊文思藍(lán)滲透法測(cè)定血腦屏障通透性 大鼠處死前1 h麻醉后經(jīng)股靜脈置管注射2%伊文思藍(lán)（MP biomedicals，美國(guó)）2 mL/kg，處死前經(jīng)頸動(dòng)脈置管灌注生理鹽水至上腔靜脈流出澄清液體。冰盤(pán)上斷頭取腦，取左半大腦部分腦組織濾紙吸干表面水分后稱(chēng)質(zhì)量，置于80 ℃鼓風(fēng)干燥箱中，烘干48 h，測(cè)腦干質(zhì)量。腦含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。將右半大腦的皮質(zhì)、海馬分離開(kāi)，用電子天秤分別精確稱(chēng)重后置于甲酰胺中，37 ℃水浴48 h后取出，離心20 min，取上清液Nanodrop2000紫外分光光度計(jì)（Thermo scientific公司，美國(guó)） 620 nm測(cè)定光密度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得伊文思藍(lán)含量^[8]。

1.2.3 TUNEL免疫熒光檢測(cè)腦細(xì)胞凋亡 使用TUNEL試劑盒（默克生物科技公司，德國(guó)）檢測(cè)腦細(xì)胞凋亡，石蠟切片樣本脫蠟水化，20 μg/mL的蛋白酶K溶液覆蓋標(biāo)本，室溫孵育20 min，TBS洗3 min×2次，每個(gè)樣本用20 μL TdT平衡緩沖液室溫孵育30 min，加入57 μL熒光素片段末端標(biāo)記反應(yīng)混合物和3 μLTdT酶37 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光孵育90 min。TBS溶液室溫孵育2 min×2次，逐滴加入含DAPI的Mounting Media 封片劑封片。綠色熒光濾光片，在465～495 nm 波長(zhǎng)下觀察被標(biāo)記的凋亡細(xì)胞。用藍(lán)色熒光濾光片，在330～380 nm波長(zhǎng)下，觀察DAPI標(biāo)記的全體細(xì)胞。在每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野（×200倍）計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)，求其平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料多組間的比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

CLP術(shù)后大鼠可見(jiàn)明顯的豎毛、懶動(dòng)、拒食、多飲。CLP組及UTI組神經(jīng)功能明顯差于Sham組（P<0.01），UTI 6 h組神經(jīng)功能評(píng)分高于CLP 6 h組（P<0.05），UTI 24 h組與CLP 24 h組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1，圖1。2.2 腦組織病理變化

CLP組較UTI組見(jiàn)大量嗜曙紅樣及核固縮的神經(jīng)細(xì)胞（↑），明顯的神經(jīng)細(xì)胞及血管周?chē)[（*），較多的血管周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)（∧），CLP 6 h組最明顯。見(jiàn)圖2～3。

2.3 腦含水量檢測(cè)

CLP 6 h組腦水腫最明顯（P<0.05），UTI 6 h組腦水腫較CLP 6 h組輕（P<0.05）。24 h各組腦水腫差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4和表3。

2.4 血腦屏障通透性比較

6 h各組間大鼠血腦屏障通透性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。24 h建模組血腦屏障通透性升高，CLP 24 h組血腦屏障通透性較UTI 24 h組顯著升高（P<0.05）。見(jiàn)圖5和表4。

2.5 神經(jīng)細(xì)胞凋亡比較

Sham組見(jiàn)少量神經(jīng)細(xì)胞凋亡，CLP 6 h組較UTI 6 h組凋亡明顯（P<0.01）。CLP 24 h組及UTI 24 h組細(xì)胞凋亡減少，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但明顯多于Sham組（P<0.01）。見(jiàn)圖6～7和表5。

TNF-α可以誘導(dǎo)BBB血管內(nèi)皮細(xì)胞間黏附分-1（ICAM-1） 的表達(dá)，促進(jìn)粒細(xì)胞及血漿白蛋白進(jìn)入腦組織，加重組織水腫^[8]。TNF-α與星形膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）結(jié)合，誘導(dǎo)水通道蛋白-4（AQP-4）表達(dá)，引起腦組織水腫^[9]。另外，TNF-α激活星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）導(dǎo)致過(guò)量NO產(chǎn)生，NO可以和O₂-直接相互作用形成過(guò)氧亞硝酸鹽和活性氧一起進(jìn)一步放大細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞^[10]。本研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁可減輕CLP大鼠腦組織水腫及BBB損傷。其機(jī)制可能與其抑制TNF-α生成進(jìn)而減少I(mǎi)CAM-1、AQP-4、iNOS等細(xì)胞因子的表達(dá)及減少活性氧生成有關(guān)^[11-14]。

膿毒癥引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未明確。有研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥早期，大鼠腦組織線粒體可逆性功能損傷，線粒體于LPS注射3 h開(kāi)始出現(xiàn)損傷，24 h趨于恢復(fù)。線粒體損傷后釋放細(xì)胞色素C進(jìn)入胞漿，誘導(dǎo)膿毒癥大鼠凋亡基因bax表達(dá)，最終激活caspase-3引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡。因此烏司他丁抑制膿毒癥腦細(xì)胞凋亡機(jī)制可能與其保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞及線粒體，減少細(xì)胞色素C釋放引起bax基因激活有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁可減少膿毒癥大鼠腦細(xì)胞的凋亡，改善神經(jīng)功能，膿毒癥6 h較明顯，24 h組保護(hù)作用不明顯，可能與烏司他丁半衰期較短，本實(shí)驗(yàn)用藥僅為術(shù)后注射1次有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1]Zhang LN， Wang XT， Ai YH， et al. Epidemiological features and risk factors of sepsis associated encephalopathy in intensive care unit patients：2008-2011 [J]. China Med， 2012， 125 （5） ： 828-831.

[2] 沈蕾， 孫正達(dá)， 陳琦， 等. 膿毒癥大鼠肺組織c-FLIP的變化及烏司他丁對(duì)c-FLIP的影響 [J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志， 2010， 19 （2）：128-131.

[3] 馬曉輝， 梁顯泉， 虞曉紅， 等. 烏司他丁對(duì)膿毒癥大鼠肺臟的保護(hù)作用 [J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志， 2011，20（1）：52-55.

[4] 張萌， 蔣龍?jiān)?楊正飛. 烏司他丁對(duì)膿毒癥大鼠腸黏膜上皮防御屏障的影響 [J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志， 2009， 16（1）： 45-48.

[5] Daniel R， Markus S， Michael A， et al. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture [J]. Nat Protoc， 2009， 4 （1）： 31-36.

[6] Kaya M， Ahishali B.Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers： evans blue， sodium fluorescein and horseradish peroxidase [J]. Methods Mol Biol. 2011；763：369-382.

[7] 姚波， 艾宇航， 張麗娜. 膿毒癥腦病大鼠血清和腦組織S100β的變化 [J]. 中華急診醫(yī)學(xué)雜志， 2014， 23（2）： 146-150.

[8] Stefan H， Christian B， Christian H， et al. Injury of the blood brain barrier and up-regulation of ICAM-1 in polymicrobial sepsis [J]. J Surg Res， 2007， 7（21）： 276-281.

[9] Alexander J， Jacob A， Cunningham P， et al. TNF is a key mediator of septic encephalopathy acting through its receptor TNF receptor-1 [J]. Neurochem Int， 2008 （52）： 447-456.

[10]Osamu H， Jancy S， Gediminas C. Role of endothelial nitric oxide synthase derived nitric oxide in activation and dysfunction of cerebrovascular endothelial cells during early onsets of sepsis [J]. Physiol Heart Circ Physiol， 2008， 295： 1712-1719.

[11] 蔣龍?jiān)?張萌， 羅正超. 烏司他丁對(duì)膿毒癥大鼠腦組織腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-6的影響 [J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志， 2008， 7（12）：1234-1237.

[12] 郭亮， 唐忠志， 張端蓮， 等. 烏司他丁對(duì)急性肺損傷組織中水通道蛋白及Fas表達(dá)的研究 [J]. 重慶醫(yī)學(xué)， 2009， 38（22）： 2873- 2875.

[13] Ryo Tanaka， Motoki Fujita， Ryosuke Tsuruta， et al. Urinary trypsin inhibitor suppresses excessive generation of superoxide anion radical， systemic inflammation， oxidative stress and endothelial injury in endotoxemic rats [J]. Inflam Res， 2010， 59（8）：597-606.

（收稿日期：2013-12-29）

（本文編輯：何小軍）

P885-889