縫隙連接蛋白43表達(dá)對難治性顳葉癲癇手術(shù)患者預(yù)后價值分析

何利兵，武 江，張培勝，孔 佳，李文玲，趙文清

難治性癲癇是指臨床對抗癲癇藥物治療反應(yīng)差的部分癲癇患者，即兩種一線藥物規(guī)治療2年以上仍有癲癇發(fā)作。顳葉癲癇為臨床最常見的難治性部分性癲癇類型，顳葉癲癇占難治性癲癇的60%～70%［1］。顳葉癲癇的手術(shù)治療效果已經(jīng)得到認(rèn)可，但手術(shù)患者的預(yù)后仍存在差異，部分患者手術(shù)后仍不能得到很好的改善，如何能夠早期判斷手術(shù)的預(yù)后具有重大的臨床意義。

縫隙連接（gap junction，GJ）是多種生理功能包括電偶聯(lián)，細(xì)胞間信息傳遞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［2］，縫隙連接蛋白（connexin，Cx）是構(gòu)成縫隙連接通道的基本功能蛋白，細(xì)胞內(nèi)的離子和小分子物質(zhì)可借此出入相鄰細(xì)胞，在神經(jīng)細(xì)胞的生長、分化以及生理功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用［3］。成年哺乳類動物腦組織中表達(dá)最強(qiáng)的是Cx43，主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)［4］。研究發(fā)現(xiàn)Cx43可能和癲癇的電傳導(dǎo)具有密切的關(guān)系，但與顳葉癲癇預(yù)后的關(guān)系研究較少。本研究就顳葉癲癇手術(shù)患者的Cx43表達(dá)和手術(shù)預(yù)后情況進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 患者篩選 回顧性分析2009年6月—2012年6月經(jīng)河北省人民醫(yī)院功能神經(jīng)外科進(jìn)行術(shù)前評估和手術(shù)治療的顳葉癲癇病例43例，篩選顳葉皮層組織標(biāo)本完整，隨訪資料完善的患者納入試驗組，如果診斷存在爭議或者合并存在其他疾病，則排除不進(jìn)入研究。隨訪方法包括進(jìn)行門診、電話、信件隨訪。對患者進(jìn)行隨訪后，根據(jù)患者癲癇發(fā)作情況按照Engel標(biāo)準(zhǔn)分級：Ⅰ級，無影響功能癲癇發(fā)作（除外術(shù)后早期的癲癇發(fā)作）；Ⅱ級，僅有稀少的影響功能的癲癇發(fā)作；Ⅲ級，癲癇發(fā)作得到相當(dāng)?shù)母纳?；Ⅳ級，癲癇發(fā)作改善不明顯［5］。

1.2 免疫組化流程 應(yīng)用SP法，按照兔抗人Connexin43單克隆抗體（SAB公司，濃度1∶100）試劑說明書進(jìn)行，制作好的免疫組化切片在Olympus光學(xué)顯微鏡下高倍鏡進(jìn)行定性觀察。按照參考文獻(xiàn)報道，Cx43在胞漿和胞膜均有表達(dá)，判定胞漿和胞膜染成棕黃色為陽性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取5個視野，PT彩色病理圖像分析系統(tǒng)在400倍高倍鏡下測量Cx43免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 經(jīng)篩選后，符合條件者45例，男31例，女14例，年齡14歲～52歲（26.6歲±11.8歲），病程2年～25年，平均9.7年。單純部分性發(fā)作27例，復(fù)雜部分性發(fā)作39例，全面性發(fā)作10例，復(fù)雜部分繼發(fā)全面強(qiáng)直陣攣性發(fā)作23例，失神發(fā)作1例。所有患者術(shù)前均長期服用過數(shù)種抗癲癇藥物，如丙戊酸鈉、卡馬西平、氯硝西泮、拉莫三嗪、左乙拉西坦等，平均用藥時間5.2年，符合難治性癲癇診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有患者術(shù)前均行長程視頻腦電圖檢查，42例監(jiān)測到臨床及腦電圖發(fā)作，腦電圖均有異常發(fā)現(xiàn)，多為高波幅陣發(fā)性或單發(fā)棘波、尖波，部分患者出現(xiàn)棘慢波復(fù)合波。

所有患者均在全身吸入靜脈復(fù)合麻醉下手術(shù)，以術(shù)前腦電圖及影像學(xué)檢查結(jié)果為依據(jù)，行擴(kuò)大翼點開顱，手術(shù)操作均在顯微鏡下完成，均行標(biāo)準(zhǔn)顳葉切除術(shù)，包括前顳葉、部分海馬等內(nèi)側(cè)結(jié)構(gòu)。術(shù)中應(yīng)用皮層腦電圖監(jiān)測，均可監(jiān)測出尖波或棘波，將病灶切除后再次進(jìn)行皮層腦電圖監(jiān)測，直至無明顯放電為止。術(shù)后常規(guī)應(yīng)用抗癲癇藥物，主要以卡馬西平為主，平均用量為900 mg／d。

2.2 隨訪結(jié)果 本組患者隨訪1年～4年，平均2.2年。術(shù)后療效按Engel標(biāo)準(zhǔn)評定，EngelⅠ級30例（66.7%），Ⅱ級9例（20.0%），Ⅲ 級4例（8.9%），Ⅳ級2例（4.4%）。效果優(yōu)良（EngelⅠ＋ Ⅱ級）39例（86.7%），效果不佳 （EngelⅢ＋ Ⅳ級）為6例（13.3%）。

2.3 免疫組織化學(xué)觀察 應(yīng)用免疫組化方法檢測Cx43在大腦皮層中的星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯表達(dá)，以胞漿或突起染成棕黃色為陽性。在手術(shù)效果良好組中平均每個視野Cx43免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞為11.48個±4.36個，在手術(shù)效果不佳組中，平均每個視野Cx43免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞為27.64個±3.78個，陽性細(xì)胞增多明顯高于手術(shù)效果良好組（P＜0.05）。

3 討 論

縫隙連接為細(xì)胞膜上的一種特殊結(jié)構(gòu)，構(gòu)成相鄰細(xì)胞間的通道，信息離子及小分子可經(jīng)其進(jìn)行細(xì)胞間轉(zhuǎn)運，是目前認(rèn)為細(xì)胞間直接交換物質(zhì)和信息的通道，是細(xì)胞間電突觸的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［2］。縫隙連接既存在于同種類型細(xì)胞之間，也存在于不同類型的細(xì)胞之間，其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多的星形膠質(zhì)細(xì)胞之間具有最廣泛的縫隙連接，這種結(jié)構(gòu)也構(gòu)成了大腦內(nèi)廣泛的信息傳遞網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。眾多研究發(fā)現(xiàn)縫隙連接在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的電活動的維持、同步化放電以及生長發(fā)育等諸多方面，都起著重要的作用，癲癇的電生理改變是大腦神經(jīng)元出現(xiàn)異常的、過度的同步性放電，提示縫隙連接也可能在癲癇的發(fā)病機(jī)制方面扮演著重要的角色。

縫隙連接蛋白是構(gòu)成縫隙連接通道的基本功能蛋白，每6個跨膜的蛋白亞基圍繞中央孔排列形成一個連接小體，相鄰細(xì)胞膜上的連接小體對接形成縫隙連接［5］。在細(xì)胞間通道形成前，半通道呈關(guān)閉狀態(tài)，而當(dāng)相鄰細(xì)胞的半通道連接時，在細(xì)胞間形成直徑約1.5 nm的通道，細(xì)胞內(nèi)的離子和小分子物質(zhì)可借此出入相鄰細(xì)胞。目前，縫隙連接蛋白是由多基因家族編碼的一大類膜蛋白，由許多成員組成，在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的連接蛋白至少有20種，分子質(zhì)量26 k D～56 k D，其中有9種Cx在成年或發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有不同程度的表達(dá)（Cx26，Cx32，Cx33，Cx36，Cx37，Cx40，Cx43，Cx45，Cx46），成年哺乳類動物腦組織中表達(dá)最強(qiáng)的是Cx43，Cx43是Cx基因家族中數(shù)量最為豐富的成員，主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)［6］。

許多研究表明，Cx43在癲癇的發(fā)生發(fā)展過程中有密切關(guān)系［7］。有研究發(fā)現(xiàn)，Cx43隨癲癇的病情發(fā)展而表達(dá)上調(diào)，Cx43的表達(dá)強(qiáng)度受癲癇發(fā)作時間的影響，癲癇發(fā)作的時間越長，Cx43表達(dá)就越多，因此，認(rèn)為Cx43很可能與癲癇發(fā)作后腦組織結(jié)構(gòu)的重塑有密切關(guān)系［8］。有學(xué)者利用用免疫組化方法和Western blot方法測定海人藻酸致癇后大鼠不同腦區(qū)、不同時間的Cx43的分布及表達(dá)情況，結(jié)果顯示海人藻酸致癇后大鼠的大腦皮層及海馬均有Cx43陽性表達(dá)，其表達(dá)與致癇時間呈正相關(guān)，發(fā)作時間越長，表達(dá)越明顯［9］。其有關(guān)機(jī)制可能是Cx43的表達(dá)增高促進(jìn)了縫隙連接的形成，增加了新的電突觸數(shù)目和電傳導(dǎo)性，導(dǎo)致神經(jīng)元同步化放電的擴(kuò)大而引起癲癇。

另外，有研究認(rèn)為廣泛的縫隙連接使星形膠質(zhì)細(xì)胞成為一個功能合胞體，當(dāng)癲癇發(fā)作時，由于大量的Ca2＋進(jìn)入了神經(jīng)元內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞外Ca2＋降低，細(xì)胞外Ca2＋減少對癇樣放電的同步化擴(kuò)散及發(fā)作起重要作用，星形膠質(zhì)細(xì)胞興奮引發(fā)的Ca2＋內(nèi)流會在這個功能合胞體中播散開來，稱為Ca2＋波，對神經(jīng)調(diào)節(jié)具有重要意義。Cx43基因敲除后，可以導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞間的縫隙連接傳導(dǎo)及Ca2＋流減弱，但Cx30，Cx40等其他Cx表達(dá)未受影響，這說明Cx43在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理活動中有著相對其他Cx更重要的作用［10］。

有研究對于手術(shù)切除難治性癲癇患者致癇灶分析發(fā)現(xiàn)Cx43 mRNA明顯升高，這可能由于癲癇發(fā)生部位的神經(jīng)元過度同步化放電，使細(xì)胞外釋放的K＋增加，為了清除過多的K＋，星形膠質(zhì)細(xì)胞使Cx43 mRNA表達(dá)代償性增加，縫隙連接數(shù)目增加，使清除K＋的能力增加，有利于維持神經(jīng)元的正常環(huán)境穩(wěn)態(tài)［6］。有研究采用難治性顳葉癲癇患者的海馬組織及正常人的海馬組織進(jìn)行對照研究，應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞激光共聚焦顯微鏡測量Cx43表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，顳葉癲癇患者的海馬組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43表達(dá)增多，Cx43含量相對于對照組明顯增加，說明這種Cx43的顯著表達(dá)可能加重顳葉癲癇患者的發(fā)作程度［11］。

對于顳葉癲癇的治療策略仍就認(rèn)為手術(shù)是最佳的治療手段，完整的切除前顳葉和海馬等內(nèi)側(cè)結(jié)構(gòu)，是獲得療效最佳的策略［12］。本研究也驗證了這種觀點，所有的患者均進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)前顳葉切除術(shù)，切除范圍包括前顳葉及海馬結(jié)構(gòu)，取得了良好的手術(shù)效果，效果優(yōu)良（EngelⅠ＋ Ⅱ級）達(dá)到86.7%。對于顳葉癲癇的手術(shù)效果，可能與多種因素有關(guān)，但均不十分確定，唯一公認(rèn)的影響手術(shù)預(yù)后的因素為不完全切除［13］，目前還沒有分子生物學(xué)指標(biāo)能夠?qū)︼D葉癲癇的手術(shù)預(yù)后有所提示。

本研究發(fā)現(xiàn)，對于手術(shù)效果不佳組顳葉癲癇患者Cx43表達(dá)較手術(shù)效果良好組明顯增高，提示此類癲癇患者已經(jīng)建立了廣泛的細(xì)胞間的縫隙連接，構(gòu)成了放電泛化的基礎(chǔ)，部分性的顳葉切除后其他部分可能仍存在癲癇放電，由此分析Cx43對于顳葉癲癇手術(shù)的預(yù)后可能具有一定的參考價值，縫隙連接蛋白阻斷劑可能是未來抗癲癇藥物的發(fā)展方向。

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