D型產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素蛋白結構及抗原表位分析

冶貴生等

摘要：利用生物軟件對D型產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素的蛋白結構、抗原表位進行預測與分析。綜合ε毒素蛋白親水性、表面可能性、抗原指數(shù)、二級結構預測結果顯示，肽鏈13-19、44-47、59-63、79-82、94-97、151-153、200-204、211-221、245-250、257-260位可能存在B細胞抗原表位，三級結構預測的94、151結合位點位于94-97、151-153抗原表位區(qū)內(nèi)。

關鍵詞：D型產(chǎn)氣莢膜梭菌；ε毒素；表位；蛋白結構

中圖分類號：S852.61 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）16-3852-03

Abstract： The protein structure and epitope of ε toxin of Clostridium perfringens type D were predicted and analyzed with biological software. The results of hydrophilicity， surface possibilities，antigen index and secondary structure showed that there were exist antigen epitope of B cell at 13-19， 44-47， 59-63， 79-82， 94-97， 151-153， 200-204， 211-221， 245-250 and 257-260 position of peptide chain. The 94，151 binding sites predicted by tertiary structure were located in the 94-97，151-153 position.

Key words： Clostridium perfringens type D； ε toxin； epitope； protein structure

D型產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種革蘭氏陽性菌，產(chǎn)芽孢，嚴重危害養(yǎng)羊業(yè)，其引起的疾病潛伏期短，發(fā)病快，死亡快[1]。ε毒素是D型產(chǎn)氣莢膜梭菌致病的主要毒素之一，ε毒素前體被激活后會對細胞產(chǎn)生毒性并增加血管滲透性[2]。ε毒素重組表達的研究表明，毒素蛋白可與抗血清結合[3]，表達產(chǎn)物免疫試驗動物可以起到免疫保護的作用[4，5]，但目前ε毒素重組表達的研究中涉及毒素抗原表位的很少。因此，本研究在前期研究基礎上[6，7]，采用多方案預測方法對D型產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素的結構與抗原表位進行預測與分析，從而為下一步D型產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素表位疫苗的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

D型產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因序列來源于前期研究工作[7]。

1.2 方法

采用Garnier-Robson[8]、Chou-Fasman[9]、Karplus-Schulz[10]方法預測ε毒素的α螺旋、β折疊、β轉角、無規(guī)則卷曲、柔韌性等二級結構；采用Kyte-Doolittle[11]方法預測其親水性；采用Jameson-Wolf[12]方法預測其抗原指數(shù)；采用Emini[13]方法預測其表面可能性；采用I-Tasser在線服務器預測其三級結構。

2 結果與分析

2.1 ε毒素二級結構預測結果

Garnier-Robson方法預測結果表明（圖1），ε毒素二級結構中α螺旋占0.766%，存在兩處單氨基酸殘基；β折疊占70.5%，在肽鏈中分布較多，主要分布區(qū)域為1-13，19-29，32-43，48-51，56-59，65-78，83-86，90-93，99-122，127-137，145-150，154-159，163-168，170-185，192-194，196-200，205-210，212-214，218-219，222-226，231-245，251-258，260-261；β轉角占11.9%，在肽鏈中分布較少，主要分布區(qū)域為14-18，45-47，87-89，94-97，189-190，201-204，220-221，227-228，259-260；無規(guī)則卷曲占17.2%，在肽鏈分布較均勻，主要分布區(qū)域為30-31，52-54，60-64，79-81，123-124，138-144，151-152，160-162，186-188，215-217，229-230，246-250。

Chou-Fasman方法預測結果表明（圖1），ε毒素二級結構中α螺旋占16.9%，在肽鏈中分布少且不均勻，存在6個區(qū)段，在肽鏈N-端分布較多，主要分布區(qū)域為21-29，34-40，67-70，72-78，83-88，235-245；β折疊占32.6%，在肽鏈中后部分布較多，主要分布區(qū)域為7-12，37-42，98-119，124-130，155-158，163-174，179-185，231-236，238-246，251-256；β轉角占39.8%，在肽鏈中分布較豐富，分布較均勻，主要分布區(qū)域為3-6，17-20，30-33，43-50，63-66，79-82，89-92，94-97，120-123，131-134，137-144，151-154，159-162，175-178，187-190，193-196，200-203，208-211，213-216，218-221，227-230，247-250，257-260。

Karplus-Schulz方法預測結果表明（圖1），ε毒素柔韌性區(qū)域較豐富，主要分布區(qū)域為5-9，11-19，24-28，39-48，53-63，77-92，94-106，108-112，123-127，130-132，137-147，151-155，161-163，172-180，183-195，200-204，209-230，244-252，且77-92，94-106，83-195，209-230四個區(qū)域連續(xù)分布跨度相對較大。

2.2 ε毒素親水性預測結果

Kyte-Doolittle方法預測結果表明（圖2），ε毒素的親水性較高，分布區(qū)域較多，主要的分布區(qū)域為1-35，40-67，77-103，105-107，120-122，134-153，172-176，186-193，198-234，245-253，256-261，且1-35，40-67，77-103，134-153，98-234這幾個分布區(qū)域，親水性氨基酸殘基連續(xù)分布相對較大。

2.3 ε毒素抗原指數(shù)預測結果

Jameson-Wolf方法預測結果表明（圖3），ε毒素抗原指數(shù)正值分布區(qū)較多，主要分布區(qū)域為1-19， 24-31，40-50，52-66，71-72，77-100，122-126，137-156，173-179，186-195，199-205，208-230，239-241，244-252，256-261，且1-19，52-66，77-100，137-156， 208-230這幾個分布區(qū)域， 抗原指數(shù)正值連續(xù)分布區(qū)相對較大。

2.4 ε毒素表面可能性預測結果

Emini方法預測結果表明（圖4），ε毒素表面可能性的分布區(qū)域為1-3，5-6，13-31，44-47，54-56，59-63，65-68，79-90，95-98，103-105，130-132，136-147，150-152，200-204，211-221，228-230，244-247，249-251，258-261，其中13-31，79-90，136-147這幾個區(qū)域，表面可能性連續(xù)分布范圍相對較大。

2.5 ε毒素抗原表位預測結果

綜合ε毒素親水性、表面可能性、抗原指數(shù)、二級結構預測結果，ε毒素的13-19，44-47，59-63，79-82，94-97，151-153，200-204，211-221，245-250，257-260位氨基酸存在可能的B細胞抗原表位。

2.6 ε毒素三級結構預測結果

應用I-Tasser在線軟件對ε毒素進行三級結構預測后得到一種模型（圖5），該模型的C-score值為1.79，在置信區(qū)間內(nèi)，模型可信度較高。三級結構預測的94，151結合位點位于“2.5”中94-97，151-153 預測區(qū)內(nèi)。

3 討論

抗原表位又稱為抗原決定簇，是抗原分子表面具有特殊立體構型和免疫活性的化學基因[14]。在蛋白質二級結構中，由于α螺旋和β折疊結構不易形變，一般不作為抗原表位考慮，而β轉角和無規(guī)則卷曲多出現(xiàn)在蛋白質表面，成為抗原表位的可能性較大?？乖砦活A測時綜合考慮白親水性、表面可能性、抗原指數(shù)、二級結構等因素，可提高預測的準確性。本研究中D型產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素二級結構預測結果中，Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法預測的α螺旋均較少，且Garnier-Robson方法預測的α螺旋只是兩處單個氨基酸，可以考慮Garnier-Robson方法預測ε毒素時不形成α螺旋。Chou-Fasman方法預測ε毒素形成的轉角區(qū)較豐富，這些轉角結構可能利于結合抗體。綜合ε毒素親水性、表面可能性、抗原指數(shù)、二級結構等預測結果，肽鏈13-19、44-47、59-63、79-82、94-97、151-153、200-204、211-221、245-250、257-260位氨基酸可能存在B細胞抗原表位，可作為表位疫苗設計時的選擇區(qū)，且三級結構預測的94、151結合位點位于94-97、151-153預測區(qū)內(nèi)，該區(qū)段稱為抗原表位的可能性較大。

致謝：感謝韓志輝教授給予的指導與幫助。

參考文獻：

[1] 陳敷言.獸醫(yī)傳染病學[M].第五版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006.

[2] MIYALMOTO O，MINAMI J，TOYOSHIMA T，et al.Neurotoxicity of clostridium perfringens epsilon toxin for the rat hippocampus via the glutamatergic system[J].Infect Immun，1998，66：2501-2508.

[3] 王 超，唐麗杰，葛俊偉，等.產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素突變基因的表達及其抗體中和效價測定[J].中國預防獸醫(yī)學報，2013，35（6）：500-503.

[4] 王光華，藺國珍，鄭福英，等.D型產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因表達及其免疫保護作用的初步研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（3）：36-41.

[5] 盧田粉，柴同杰，孫玲玉，等.產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素蛋白高效表達體系的構建及其免疫保護性的研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（9）：59-62.

[6] 冶貴生，康耀鵬，張龍剛.D型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要毒素基因的PCR檢測[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012（2）：107-108.

[7] 冶貴生.D型產(chǎn)氣莢膜梭菌青海分離株ε毒素遺傳變異分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2012，51（15）：3183-3185.

[8] GARNIER J，OSGUTHORPE D J，ROBSON B.Analysis of the accuracy and implications of simple method for predicting the secondary structure of globular proteins[J]. J Mol Biol，1978，120（1）：97-120.

[9] CHOU P Y，F(xiàn)ASMAN G D.Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequence[J].Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol，1978，47：45-148.

[10] KARPLUS P A，SCHULTZ G E.Prediction of chain flexibility in proteins[J].Naturwissenschaften，1985，72：212-213.

[11] KYTE J，DOOLITTLE R F.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[J].J Mol Biol，1982，157（1）：105-132.

[12] JAMESON B A，WOLF H.The antigenic index：A novel algorithm for predicting antigenic determinants[J].Comput Appl Biosci，1988，4（1）：181-186.

[13] EMINI E A，HUGHES J V，PERLOW D S，et al.Induction of hepatitis a virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide[J].J Virol，1985，55（3）：836-839.

[14] 陸承平.獸醫(yī)微生物學[M].第三版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

（責任編輯 程碧軍）

2.2 ε毒素親水性預測結果

Kyte-Doolittle方法預測結果表明（圖2），ε毒素的親水性較高，分布區(qū)域較多，主要的分布區(qū)域為1-35，40-67，77-103，105-107，120-122，134-153，172-176，186-193，198-234，245-253，256-261，且1-35，40-67，77-103，134-153，98-234這幾個分布區(qū)域，親水性氨基酸殘基連續(xù)分布相對較大。

2.3 ε毒素抗原指數(shù)預測結果

Jameson-Wolf方法預測結果表明（圖3），ε毒素抗原指數(shù)正值分布區(qū)較多，主要分布區(qū)域為1-19， 24-31，40-50，52-66，71-72，77-100，122-126，137-156，173-179，186-195，199-205，208-230，239-241，244-252，256-261，且1-19，52-66，77-100，137-156， 208-230這幾個分布區(qū)域， 抗原指數(shù)正值連續(xù)分布區(qū)相對較大。

2.4 ε毒素表面可能性預測結果

Emini方法預測結果表明（圖4），ε毒素表面可能性的分布區(qū)域為1-3，5-6，13-31，44-47，54-56，59-63，65-68，79-90，95-98，103-105，130-132，136-147，150-152，200-204，211-221，228-230，244-247，249-251，258-261，其中13-31，79-90，136-147這幾個區(qū)域，表面可能性連續(xù)分布范圍相對較大。

2.5 ε毒素抗原表位預測結果

綜合ε毒素親水性、表面可能性、抗原指數(shù)、二級結構預測結果，ε毒素的13-19，44-47，59-63，79-82，94-97，151-153，200-204，211-221，245-250，257-260位氨基酸存在可能的B細胞抗原表位。

2.6 ε毒素三級結構預測結果

應用I-Tasser在線軟件對ε毒素進行三級結構預測后得到一種模型（圖5），該模型的C-score值為1.79，在置信區(qū)間內(nèi)，模型可信度較高。三級結構預測的94，151結合位點位于“2.5”中94-97，151-153 預測區(qū)內(nèi)。

3 討論

抗原表位又稱為抗原決定簇，是抗原分子表面具有特殊立體構型和免疫活性的化學基因[14]。在蛋白質二級結構中，由于α螺旋和β折疊結構不易形變，一般不作為抗原表位考慮，而β轉角和無規(guī)則卷曲多出現(xiàn)在蛋白質表面，成為抗原表位的可能性較大。抗原表位預測時綜合考慮白親水性、表面可能性、抗原指數(shù)、二級結構等因素，可提高預測的準確性。本研究中D型產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素二級結構預測結果中，Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法預測的α螺旋均較少，且Garnier-Robson方法預測的α螺旋只是兩處單個氨基酸，可以考慮Garnier-Robson方法預測ε毒素時不形成α螺旋。Chou-Fasman方法預測ε毒素形成的轉角區(qū)較豐富，這些轉角結構可能利于結合抗體。綜合ε毒素親水性、表面可能性、抗原指數(shù)、二級結構等預測結果，肽鏈13-19、44-47、59-63、79-82、94-97、151-153、200-204、211-221、245-250、257-260位氨基酸可能存在B細胞抗原表位，可作為表位疫苗設計時的選擇區(qū)，且三級結構預測的94、151結合位點位于94-97、151-153預測區(qū)內(nèi)，該區(qū)段稱為抗原表位的可能性較大。

致謝：感謝韓志輝教授給予的指導與幫助。

參考文獻：

[1] 陳敷言.獸醫(yī)傳染病學[M].第五版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006.

[2] MIYALMOTO O，MINAMI J，TOYOSHIMA T，et al.Neurotoxicity of clostridium perfringens epsilon toxin for the rat hippocampus via the glutamatergic system[J].Infect Immun，1998，66：2501-2508.

[3] 王 超，唐麗杰，葛俊偉，等.產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素突變基因的表達及其抗體中和效價測定[J].中國預防獸醫(yī)學報，2013，35（6）：500-503.

[4] 王光華，藺國珍，鄭福英，等.D型產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因表達及其免疫保護作用的初步研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（3）：36-41.

[5] 盧田粉，柴同杰，孫玲玉，等.產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素蛋白高效表達體系的構建及其免疫保護性的研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（9）：59-62.

[6] 冶貴生，康耀鵬，張龍剛.D型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要毒素基因的PCR檢測[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012（2）：107-108.

[7] 冶貴生.D型產(chǎn)氣莢膜梭菌青海分離株ε毒素遺傳變異分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2012，51（15）：3183-3185.

[8] GARNIER J，OSGUTHORPE D J，ROBSON B.Analysis of the accuracy and implications of simple method for predicting the secondary structure of globular proteins[J]. J Mol Biol，1978，120（1）：97-120.

[9] CHOU P Y，F(xiàn)ASMAN G D.Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequence[J].Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol，1978，47：45-148.

[10] KARPLUS P A，SCHULTZ G E.Prediction of chain flexibility in proteins[J].Naturwissenschaften，1985，72：212-213.

[11] KYTE J，DOOLITTLE R F.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[J].J Mol Biol，1982，157（1）：105-132.

[12] JAMESON B A，WOLF H.The antigenic index：A novel algorithm for predicting antigenic determinants[J].Comput Appl Biosci，1988，4（1）：181-186.

[13] EMINI E A，HUGHES J V，PERLOW D S，et al.Induction of hepatitis a virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide[J].J Virol，1985，55（3）：836-839.

[14] 陸承平.獸醫(yī)微生物學[M].第三版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

（責任編輯 程碧軍）

2.2 ε毒素親水性預測結果

Kyte-Doolittle方法預測結果表明（圖2），ε毒素的親水性較高，分布區(qū)域較多，主要的分布區(qū)域為1-35，40-67，77-103，105-107，120-122，134-153，172-176，186-193，198-234，245-253，256-261，且1-35，40-67，77-103，134-153，98-234這幾個分布區(qū)域，親水性氨基酸殘基連續(xù)分布相對較大。

2.3 ε毒素抗原指數(shù)預測結果

Jameson-Wolf方法預測結果表明（圖3），ε毒素抗原指數(shù)正值分布區(qū)較多，主要分布區(qū)域為1-19， 24-31，40-50，52-66，71-72，77-100，122-126，137-156，173-179，186-195，199-205，208-230，239-241，244-252，256-261，且1-19，52-66，77-100，137-156， 208-230這幾個分布區(qū)域， 抗原指數(shù)正值連續(xù)分布區(qū)相對較大。

2.4 ε毒素表面可能性預測結果

Emini方法預測結果表明（圖4），ε毒素表面可能性的分布區(qū)域為1-3，5-6，13-31，44-47，54-56，59-63，65-68，79-90，95-98，103-105，130-132，136-147，150-152，200-204，211-221，228-230，244-247，249-251，258-261，其中13-31，79-90，136-147這幾個區(qū)域，表面可能性連續(xù)分布范圍相對較大。

2.5 ε毒素抗原表位預測結果

綜合ε毒素親水性、表面可能性、抗原指數(shù)、二級結構預測結果，ε毒素的13-19，44-47，59-63，79-82，94-97，151-153，200-204，211-221，245-250，257-260位氨基酸存在可能的B細胞抗原表位。

2.6 ε毒素三級結構預測結果

應用I-Tasser在線軟件對ε毒素進行三級結構預測后得到一種模型（圖5），該模型的C-score值為1.79，在置信區(qū)間內(nèi)，模型可信度較高。三級結構預測的94，151結合位點位于“2.5”中94-97，151-153 預測區(qū)內(nèi)。

3 討論

抗原表位又稱為抗原決定簇，是抗原分子表面具有特殊立體構型和免疫活性的化學基因[14]。在蛋白質二級結構中，由于α螺旋和β折疊結構不易形變，一般不作為抗原表位考慮，而β轉角和無規(guī)則卷曲多出現(xiàn)在蛋白質表面，成為抗原表位的可能性較大。抗原表位預測時綜合考慮白親水性、表面可能性、抗原指數(shù)、二級結構等因素，可提高預測的準確性。本研究中D型產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素二級結構預測結果中，Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法預測的α螺旋均較少，且Garnier-Robson方法預測的α螺旋只是兩處單個氨基酸，可以考慮Garnier-Robson方法預測ε毒素時不形成α螺旋。Chou-Fasman方法預測ε毒素形成的轉角區(qū)較豐富，這些轉角結構可能利于結合抗體。綜合ε毒素親水性、表面可能性、抗原指數(shù)、二級結構等預測結果，肽鏈13-19、44-47、59-63、79-82、94-97、151-153、200-204、211-221、245-250、257-260位氨基酸可能存在B細胞抗原表位，可作為表位疫苗設計時的選擇區(qū)，且三級結構預測的94、151結合位點位于94-97、151-153預測區(qū)內(nèi)，該區(qū)段稱為抗原表位的可能性較大。

致謝：感謝韓志輝教授給予的指導與幫助。

參考文獻：

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（責任編輯 程碧軍）