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    母豬糞便中乳酸菌菌株體外益生特性初步研究

    2014-10-19 06:01:20楊燕萍王葉琛周志江鄭成江
    中國飼料 2014年14期
    關(guān)鍵詞:膽鹽存活率乳酸菌

    王 津, 楊燕萍, 王葉琛, 周志江, 韓 燁, 鄭成江, 范 寰*

    (1.天津大學(xué)化工學(xué)院,天津南開 300072;2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所,天津西青 300384)

    微生態(tài)制劑可通過調(diào)節(jié)動(dòng)物胃腸道微生態(tài)區(qū)系平衡,預(yù)防疾病、促進(jìn)動(dòng)物生長并且提高飼料利用率(安娜等,2010;Setia 等,2009)。 有研究表明,在母豬飼料中添加微生態(tài)制劑,可以提高母豬的生長繁殖性能、改善母豬腸道健康、提高母豬免疫力(Treut等,2009)。乳酸菌是應(yīng)用最早、最廣泛的微生態(tài)制劑,乳酸菌通過代謝產(chǎn)生揮發(fā)性短鏈脂肪酸、過氧化氫、細(xì)菌素等物質(zhì)抑制甚至殺死致病菌,調(diào)整消化道菌群組成,維持胃腸道菌群平衡,增強(qiáng)動(dòng)物免疫力(Femandez等,2003;Alvarez-Olmos和Oberhelman,2001)。乳酸菌作為微生態(tài)制劑用于提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和健康水平,效果差異較大,原因之一就是菌株定植的宿主特異性(Timmerman等,2006)。因此,理想的微生態(tài)制劑菌種最好來自于同源動(dòng)物的腸道(Fuller,1989)。本研究旨在從健康母豬糞便中分離出適于母豬應(yīng)用的乳酸菌,為畜牧生產(chǎn)中微生態(tài)制劑的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基:葡萄糖2 g,酵母提取物 0.5 g,胰蛋白胨 1 g,牛肉膏 1 g,磷酸氫二鉀0.2 g,乙酸鈉 0.5 g,檸檬酸銨 0.2 g,硫酸鎂 0.058 g,硫酸錳 0.025 g,吐溫-800.1 g,水 100 mL,pH 6.5。LB培養(yǎng)基:大豆蛋白胨1 g,酵母提取物0.5 g,氯化鈉 1 g,水 100 mL,pH 7.0。TSYEB 培養(yǎng)基:葡萄糖0.25 g,胰蛋白胨1.7 g,酵母提取物 0.6 g,大豆蛋白胨0.3 g,氯化鈉0.5 g,磷酸氫二鉀0.25 g,水100 mL,pH 7.1~7.5。生理生化試驗(yàn)培養(yǎng)基(明膠液化、硝酸鹽還原、硫化氫產(chǎn)生和糖類發(fā)酵試驗(yàn)用培養(yǎng)基)按文獻(xiàn)配制(崔保安等,2005)。

    1.2 指示菌 大腸埃希氏菌 (Escherichia coli),由天津大學(xué)食品科學(xué)系食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌 (Listeria monocytogenes)CVCC1591,購于中國獸藥監(jiān)察中心。

    1.3 樣品采集及處理 選定健康母豬,使用滅菌棉簽蘸取剛排出的新鮮糞便,置于滅菌試管中,冷藏并迅速取樣。將采集的母豬糞樣0.5 g置于4.5 mL滅菌生理鹽水中,振蕩均勻。然后進(jìn)行10倍倍比稀釋,10-7~10-1,共7個(gè)稀釋度。吸取梯度稀釋液100 μL于固體MRS培養(yǎng)基平板上均勻涂布。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,挑取10株單菌落,反復(fù)劃線純化到獲得純菌株為止。

    1.4 形態(tài)和生理生化鑒定 將純化好的菌落進(jìn)行菌落形態(tài)觀察,革蘭氏染色和鏡檢。對革蘭氏染色呈陽性且無芽孢的菌株進(jìn)行接觸酶、明膠液化、硝酸鹽還原、硫化氫產(chǎn)生和糖類發(fā)酵試驗(yàn),37℃培養(yǎng)1~2 d。試驗(yàn)結(jié)果對照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》(第8版)進(jìn)行綜合判定。

    1.5 乳酸菌16S rDNA鑒定

    1.5.1 細(xì)菌DNA的制備 將乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)24 h。取1.5 mL培養(yǎng)液于離心管中,12000 r/min離心30 s,棄上清,收集菌體。向每管中加入200 μL裂解緩沖液(40 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0;2 mmol/L CH3COONa;1 mmol/L EDTA;1%SDS),迅速強(qiáng)烈抽吸,懸浮和裂解細(xì)胞, 再加入 50 μL 100 μg/mL溶菌酶,37℃處理30 min。然后加入10 μL 10 mg/mL蛋白酶K,37℃處理 30 min。再加入 66 μL 5 mol/L NaCl溶液,充分混勻后,12000 r/min離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新管中,加入等體積Tris飽和苯酚,充分混勻后,12000 r/min離心3 min。取離心后水層,加等體積氯仿,充分混勻,12000 r/min離心3 min。取上清,加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇沉淀30 min,再15000 r/min離心15 min,棄上清。使用400 μL 70%乙醇洗滌2次,12000 r/min離心2 min,棄上清。真空干燥后,50 μL超純水溶解DNA,-20℃放置備用。

    1.5.2 PCR擴(kuò)增 所用細(xì)菌16S rDNA全長通用引物序列如下(Maiwald 等,1994):

    上 游 引 物 8f:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;

    下游引物 1492r:5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

    PCR擴(kuò)增采用25 μL體系,其中DNA模板1 μL;10×Taq Buffer 2.5 μL;Mg2+1.8 μL;dNTP 1 μL;上游引物(10 μmoL/L)0.5 μL;下游引物(10 μmoL/L)0.5 μL;Taq DNA 聚合酶(0.5 U/mL)0.2 μL;超純水 17.5 μL。

    PCR擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性 30 s,55 ℃退火 60 s,72 ℃延伸 90 s,循環(huán) 30次;72 ℃延伸 5 min(Zhao等,2013)。

    1.5.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析 以1倍TAE緩沖液配制1.0%瓊脂糖凝膠。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL,加入溴酚藍(lán)指示劑,混勻后加樣。100 V電泳30 min。溴化乙錠染色20 min,紫外燈下觀察電泳結(jié)果。

    1.5.4 測序及序列比對 擴(kuò)增出鑒定細(xì)菌的16S rDNA片段,PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行純化和測序后做Blast分析,并在GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) 中 比對,獲得鑒定結(jié)果。

    1.6 耐酸試驗(yàn) 將保藏的菌株按5%(V/V)的接種量接種,活化2~3代以保證菌株的高活性,活化培養(yǎng)時(shí)間為24 h。將最后一次活化好的菌液按1%(V/V)接種量接入 pH 值分別為 2.0、2.5、3.0 的MRS液體培養(yǎng)基中,同時(shí)接入不加酸的MRS液體培養(yǎng)基中作為對照。3 h后,分別吸取酸處理組和對照組菌液100 μL進(jìn)行涂布,培養(yǎng)24 h后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。計(jì)算存活率:

    A/%=X/X0×100;

    式中:A為酸處理過的存活率;X為處理3 h后每毫升的活菌數(shù);X0為對照組3 h后每毫升的活菌數(shù)。

    1.7 耐膽鹽試驗(yàn) 在MRS液體培養(yǎng)基中加入0.1%、0.2%、0.3%(m/V)豬膽鹽搖勻,方法同上述耐酸試驗(yàn)。計(jì)算存活率:

    B/%=Y/Y0×100;

    式中:B為豬膽鹽處理過的存活率;Y為處理3 h后每毫升的活菌數(shù);Y0為對照組3 h后每毫升的活菌數(shù)。

    1.8 抑菌試驗(yàn) 采用牛津杯法對所述乳酸菌菌株進(jìn)行抑菌活性測定。將指示菌大腸埃希氏菌、單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌按1%(V/V)接種量分別接種于LB、TSYEB液體培養(yǎng)基中,37℃恒溫培養(yǎng)24 h備用。將乳酸菌菌株發(fā)酵液以1%(V/V)接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37℃恒溫培養(yǎng)24 h備用。取滅菌培養(yǎng)皿,注入滅菌的MRS固體培養(yǎng)基15 mL,水平放置使之凝固,作為底層。放入已滅菌的牛津杯,將含有200 μL指示菌的20 mL的LB、TSYEB半固體培養(yǎng)基混勻,倒入平板,冷凝后取出牛津杯。在孔中加入200 μL乳酸菌菌液,于4℃擴(kuò)散4 h,37℃恒溫培養(yǎng)24 h后,測量抑菌圈直徑,每個(gè)處理做3個(gè)平行試驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 形態(tài)和生理生化特征 試驗(yàn)共分離了10株疑似乳酸菌菌株,它們在MRS瓊脂平板上為圓整、光滑、隆起、乳白色露滴樣小菌落。乳酸菌是指發(fā)酵糖類且主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱。由于3、4號和5號菌株革蘭氏染色呈陰性,故可認(rèn)定其不是乳酸菌。其余7個(gè)菌株形態(tài)及主要生化特征結(jié)果見表1。通過與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》(第8版)中乳酸菌屬的描述相對照,初步鑒定1號菌株為鏈球菌屬,2號和8號菌株為乳桿菌屬,6、7、9號和10號菌株為片球菌屬。

    表1 菌株的形態(tài)及主要生化特征

    2.2 16S rDNA的序列分析 分離菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。由圖1可知,各分離菌株均得到一條清晰的條帶,與Marker相比,所獲得的擴(kuò)增片段大小在1500 bp左右,說明所得PCR產(chǎn)物為目的產(chǎn)物,可以純化后進(jìn)行測序。將7株試驗(yàn)菌株的長度大約為1500 bp的16S rDNA序列輸入到GenBank中,尋找與其同源性最高的菌株。7株乳酸菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物比對結(jié)果:菌株1與Streptococcus sp.的16S rDNA序列的同源性達(dá)到了99%,菌株2和8與Lactobacillus johnsonii的16S rDNA序列的同源性達(dá)到了99%,菌株6、7、9和 10與 Pediococcus acidilactici的 16S rDNA序列的同源性達(dá)到了99%。綜合主要生理生化特征與16S rDNA保守序列分析,鑒定結(jié)果為:菌株1為鏈球菌,菌株2和8為約氏乳桿菌,菌株6、7、9、10為乳酸片球菌。

    圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

    2.3 耐酸試驗(yàn) 成年母豬胃中的pH值較低,一般為2.0~3.0(張名濤等,2003),胃環(huán)境對細(xì)菌的破壞是依賴性的酸水解作用,因此微生態(tài)制劑必須有良好的耐酸能力,才能通過高酸性的胃環(huán)境而達(dá)到腸道發(fā)揮作用。食物通過胃的排空時(shí)間一般為2 h左右,本試驗(yàn)考察3 h內(nèi)菌株在不同pH條件下菌株的存活率(%),結(jié)果見表2。分離的菌株都表現(xiàn)出了較強(qiáng)的酸耐受性,pH 3.0處理后存活率均在36%以上,pH 2.5處理后存活率均在26%以上。即使在pH 2.0處理后,所有菌株對酸仍還有一定的耐受性,且均在18%以上。菌株對于耐酸性的能力:1>7>6>2>10>9>8。

    表2 不同pH條件下菌株的存活率 %

    2.4 耐膽鹽試驗(yàn) 乳酸菌進(jìn)入腸道后,小腸中膽鹽的高滲透壓環(huán)境不利于其存活。成年母豬小腸內(nèi)膽鹽濃度在0.03%~0.30%波動(dòng)。本試驗(yàn)考察3 h內(nèi)菌株在不同膽鹽濃度條件下菌株的存活率,結(jié)果見表3。分離的菌株都表現(xiàn)出了較強(qiáng)的膽鹽耐受性,0.1%膽鹽處理后存活率均在50%以上,0.2%膽鹽處理后存活率均在29%以上。即使在0.3%膽鹽處理后,所有菌株對膽鹽仍還有一定的耐受性,且均在15%以上。菌株的耐膽鹽的能力:8>2>9>10>6>1>7。

    表3 不同膽鹽濃度條件下菌株的存活率%

    2.5 抑菌試驗(yàn) 菌株對大腸埃希氏菌、單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌的抑制作用結(jié)果見表4。由表4可知,所有菌株對2株指示菌均有較強(qiáng)的抑制作用,對大腸埃希氏菌抑菌圈直徑為14.53~18.97 mm,而對單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌抑菌圈直徑為5.83~10.27 mm,即所有菌株對大腸埃希氏菌的抑菌效果均強(qiáng)于單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌。

    表4 菌株對大腸埃希氏菌、單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌的抑制作用 mm

    3 討論

    近年來,微生態(tài)制劑在仔豬、育肥豬中研究和應(yīng)用的較多,但是在母豬生產(chǎn)中的研究和應(yīng)用相對較少,然而母豬在養(yǎng)豬業(yè)中占有很大的比重,母豬的健康直接關(guān)系著整個(gè)養(yǎng)豬業(yè)的生產(chǎn)效率 (李彪和楊乃歡,2009)。健康母豬腸道內(nèi)的微生物菌群彼此之間相互依存,相互制約,維護(hù)著母豬腸道內(nèi)菌群平衡。但是當(dāng)母豬懷孕后身體機(jī)能會(huì)出現(xiàn)一系列的變化,如果飼養(yǎng)管理、營養(yǎng)等各方面沒做好,會(huì)對產(chǎn)仔數(shù)和斷奶有重大的影響。規(guī)?;B(yǎng)豬場懷孕母豬最容易出現(xiàn)的問題是便秘、采食量低、產(chǎn)后奶水不足、免疫力下降等問題。另外,母豬腸道菌群的健康直接影響哺乳仔豬的健康。新生仔豬腸道是無菌的,當(dāng)其通過母豬產(chǎn)道、采食母乳、與環(huán)境接觸等腸道內(nèi)開始定植多種菌群。如果母豬腸道菌群失調(diào),會(huì)有大量的有害菌隨糞便排入到環(huán)境中,從而增加了仔豬患病的機(jī)會(huì)。因此,開發(fā)研究供母豬應(yīng)用的微生態(tài)制劑具有重要意義。

    乳酸菌作為微生態(tài)制劑可直接飼喂動(dòng)物,它以活菌形式在動(dòng)物消化道中與病原菌通過競爭性抑制作用增強(qiáng)機(jī)體免疫力,并直接參與胃腸道微生態(tài)平衡調(diào)節(jié)(陳紅梅等,2006)。然而乳酸菌在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用效果不顯著,益生作用變異范圍大,其中的一個(gè)重要原因是所用菌株在動(dòng)物腸道中難以存活(李太元等,2005),寄主和腸道菌群之間存在著相互選擇、相互依賴的關(guān)系,因而一種適于某類動(dòng)物的微生態(tài)制劑未必適于另一種動(dòng)物,因此理想的微生態(tài)制劑菌種最好來自同源動(dòng)物的腸道,只有這樣才能增強(qiáng)益生菌功效。因此,本研究以健康母豬糞便為樣本,分離并鑒定可作為微生態(tài)制劑的乳酸菌。

    菌株分離是一項(xiàng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作,因此培養(yǎng)基的選擇至關(guān)重要,使用合適的培養(yǎng)基可以減少工作量,提高工作效率,加快研究進(jìn)度。本試驗(yàn)采用MRS培養(yǎng)基作為分離培養(yǎng)基,因其含有高濃度的乙酸鹽離子,并有刺激因子吐溫-80,可抑制其他微生物的生長,起到選擇培養(yǎng)的作用(林朝洪,2007),因而能從糞便這種復(fù)雜區(qū)系中選擇培養(yǎng)出乳酸菌。在整個(gè)培養(yǎng)過程中均采取有氧培養(yǎng),分離出的乳酸菌均為堿性厭氧菌。

    對菌株進(jìn)行有效、準(zhǔn)確鑒定是開發(fā)和利用它們的前提條件。生理生化特征是微生物分類的重要依據(jù)之一,理論上可以通過生理生化試驗(yàn)對菌株進(jìn)行鑒定。但是,利用生理生化特征對微生物鑒定是根據(jù)最大相似性的原則進(jìn)行分類,由于種間生理生化特征差異較小,并且一些生理生化特征因長期受到生長環(huán)境的影響會(huì)發(fā)生改變。而分子鑒定法中16S rDNA相對分子質(zhì)量適中,其基因核苷酸序列具有高度保守性。但它的保守性又是相對的,在保守區(qū)之間有9~10個(gè)變異區(qū),不同科、屬、種間都具有一定的變異,可利用可變區(qū)序列的差異對不同菌屬、菌種的細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定。因此本試驗(yàn)將主要生理生化特征鑒定與16S rDNA保守序列分析相結(jié)合,增加了鑒定的可信度。

    微生態(tài)制劑飼喂動(dòng)物后能否在動(dòng)物的腸道內(nèi)定植除了本身必須具備抑制有害微生物繁殖的特點(diǎn)外,還必須能夠耐胃腸道中的生理環(huán)境,在其中存活并繁殖(王玉華等,2006)。乳酸菌能在較低酸性環(huán)境下存活,與其自身具有耐酸保護(hù)機(jī)制有關(guān),它能產(chǎn)生細(xì)胞質(zhì)緩沖物質(zhì),合成酸或堿性物質(zhì),向胞外運(yùn)送氫離子(暢天獅等,2002)。但是當(dāng)pH過低或過高時(shí),乳酸菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞,通透性和滲透壓升高,最終導(dǎo)致細(xì)胞破裂死亡。而豬胃液的pH與豬齡、飼料類型等因素有關(guān),成年母豬胃液pH相對穩(wěn)定,為2.0~3.0,因此對于應(yīng)用于母豬的微生態(tài)制劑篩選的酸性條件,一般選擇pH為2.0、2.5和3.0。篩選微生態(tài)制劑要考慮的另一個(gè)重要因素是具備耐受小腸中膽汁形成的高滲透壓環(huán)境的能力。肝臟分泌到十二指腸中的高濃度膽酸鹽抗菌活性較強(qiáng),對細(xì)胞膜有很強(qiáng)的破壞能力,其疏水作用可使乳酸菌細(xì)胞膜損壞。小腸中膽汁鹽含量在0.03%~0.3%,因此對于應(yīng)用于母豬的微生態(tài)制劑篩選的膽鹽濃度為0.1%、0.2%和0.3%。

    4 結(jié)論

    本試驗(yàn)從健康母豬糞便中分離純化出7株乳酸菌,分別為鏈球菌、約氏乳桿菌和乳酸片球菌;所有菌株在pH 2.0~3.0、膽鹽濃度0.1%~0.3%,均有較強(qiáng)的耐受能力;體外抑菌試驗(yàn)表明各菌株對大腸埃希氏菌和單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌均有拮抗作用,具備了益生菌的基本條件,為研究與開發(fā)微生態(tài)制劑奠定了基礎(chǔ)。

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