母豬糞便中乳酸菌菌株體外益生特性初步研究

王 津， 楊燕萍， 王葉琛， 周志江， 韓 燁， 鄭成江， 范 寰＊

（1.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津南開 300072；2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津西青 300384）

微生態(tài)制劑可通過調(diào)節(jié)動(dòng)物胃腸道微生態(tài)區(qū)系平衡，預(yù)防疾病、促進(jìn)動(dòng)物生長并且提高飼料利用率（安娜等，2010；Setia 等，2009）。 有研究表明，在母豬飼料中添加微生態(tài)制劑，可以提高母豬的生長繁殖性能、改善母豬腸道健康、提高母豬免疫力（Treut等，2009）。乳酸菌是應(yīng)用最早、最廣泛的微生態(tài)制劑，乳酸菌通過代謝產(chǎn)生揮發(fā)性短鏈脂肪酸、過氧化氫、細(xì)菌素等物質(zhì)抑制甚至殺死致病菌，調(diào)整消化道菌群組成，維持胃腸道菌群平衡，增強(qiáng)動(dòng)物免疫力（Femandez等，2003；Alvarez-Olmos和Oberhelman，2001）。乳酸菌作為微生態(tài)制劑用于提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和健康水平，效果差異較大，原因之一就是菌株定植的宿主特異性（Timmerman等，2006）。因此，理想的微生態(tài)制劑菌種最好來自于同源動(dòng)物的腸道（Fuller，1989）。本研究旨在從健康母豬糞便中分離出適于母豬應(yīng)用的乳酸菌，為畜牧生產(chǎn)中微生態(tài)制劑的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，酵母提取物 0.5 g，胰蛋白胨 1 g，牛肉膏 1 g，磷酸氫二鉀0.2 g，乙酸鈉 0.5 g，檸檬酸銨 0.2 g，硫酸鎂 0.058 g，硫酸錳 0.025 g，吐溫-800.1 g，水 100 mL，pH 6.5。LB培養(yǎng)基：大豆蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，氯化鈉 1 g，水 100 mL，pH 7.0。TSYEB 培養(yǎng)基：葡萄糖0.25 g，胰蛋白胨1.7 g，酵母提取物 0.6 g，大豆蛋白胨0.3 g，氯化鈉0.5 g，磷酸氫二鉀0.25 g，水100 mL，pH 7.1～7.5。生理生化試驗(yàn)培養(yǎng)基（明膠液化、硝酸鹽還原、硫化氫產(chǎn)生和糖類發(fā)酵試驗(yàn)用培養(yǎng)基）按文獻(xiàn)配制（崔保安等，2005）。

1.2 指示菌 大腸埃希氏菌 （Escherichia coli），由天津大學(xué)食品科學(xué)系食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌 （Listeria monocytogenes）CVCC1591，購于中國獸藥監(jiān)察中心。

1.3 樣品采集及處理 選定健康母豬，使用滅菌棉簽蘸取剛排出的新鮮糞便，置于滅菌試管中，冷藏并迅速取樣。將采集的母豬糞樣0.5 g置于4.5 mL滅菌生理鹽水中，振蕩均勻。然后進(jìn)行10倍倍比稀釋，10-7～10-1，共7個(gè)稀釋度。吸取梯度稀釋液100 μL于固體MRS培養(yǎng)基平板上均勻涂布。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取10株單菌落，反復(fù)劃線純化到獲得純菌株為止。

1.4 形態(tài)和生理生化鑒定 將純化好的菌落進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，革蘭氏染色和鏡檢。對革蘭氏染色呈陽性且無芽孢的菌株進(jìn)行接觸酶、明膠液化、硝酸鹽還原、硫化氫產(chǎn)生和糖類發(fā)酵試驗(yàn)，37℃培養(yǎng)1～2 d。試驗(yàn)結(jié)果對照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（第8版）進(jìn)行綜合判定。

1.5 乳酸菌16S rDNA鑒定

1.5.1 細(xì)菌DNA的制備 將乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)24 h。取1.5 mL培養(yǎng)液于離心管中，12000 r/min離心30 s，棄上清，收集菌體。向每管中加入200 μL裂解緩沖液（40 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；2 mmol/L CH3COONa；1 mmol/L EDTA；1%SDS），迅速強(qiáng)烈抽吸，懸浮和裂解細(xì)胞， 再加入 50 μL 100 μg/mL溶菌酶，37℃處理30 min。然后加入10 μL 10 mg/mL蛋白酶K，37℃處理 30 min。再加入 66 μL 5 mol/L NaCl溶液，充分混勻后，12000 r/min離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新管中，加入等體積Tris飽和苯酚，充分混勻后，12000 r/min離心3 min。取離心后水層，加等體積氯仿，充分混勻，12000 r/min離心3 min。取上清，加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇沉淀30 min，再15000 r/min離心15 min，棄上清。使用400 μL 70%乙醇洗滌2次，12000 r/min離心2 min，棄上清。真空干燥后，50 μL超純水溶解DNA，-20℃放置備用。

1.5.2 PCR擴(kuò)增 所用細(xì)菌16S rDNA全長通用引物序列如下（Maiwald 等，1994）：

上 游 引 物 8f：5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

下游引物 1492r：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

PCR擴(kuò)增采用25 μL體系，其中DNA模板1 μL；10×Taq Buffer 2.5 μL；Mg2+1.8 μL；dNTP 1 μL；上游引物（10 μmoL/L）0.5 μL；下游引物（10 μmoL/L）0.5 μL；Taq DNA 聚合酶（0.5 U/mL）0.2 μL；超純水 17.5 μL。

PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性 30 s，55 ℃退火 60 s，72 ℃延伸 90 s，循環(huán) 30次；72 ℃延伸 5 min（Zhao等，2013）。

1.5.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析 以1倍TAE緩沖液配制1.0%瓊脂糖凝膠。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，加入溴酚藍(lán)指示劑，混勻后加樣。100 V電泳30 min。溴化乙錠染色20 min，紫外燈下觀察電泳結(jié)果。

1.5.4 測序及序列比對 擴(kuò)增出鑒定細(xì)菌的16S rDNA片段，PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行純化和測序后做Blast分析，并在GenBank （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast） 中 比對，獲得鑒定結(jié)果。

1.6 耐酸試驗(yàn) 將保藏的菌株按5%（V/V）的接種量接種，活化2～3代以保證菌株的高活性，活化培養(yǎng)時(shí)間為24 h。將最后一次活化好的菌液按1%（V/V）接種量接入 pH 值分別為 2.0、2.5、3.0 的MRS液體培養(yǎng)基中，同時(shí)接入不加酸的MRS液體培養(yǎng)基中作為對照。3 h后，分別吸取酸處理組和對照組菌液100 μL進(jìn)行涂布，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。計(jì)算存活率：

A/%=X/X0×100；

式中：A為酸處理過的存活率；X為處理3 h后每毫升的活菌數(shù)；X0為對照組3 h后每毫升的活菌數(shù)。

1.7 耐膽鹽試驗(yàn) 在MRS液體培養(yǎng)基中加入0.1%、0.2%、0.3%（m/V）豬膽鹽搖勻，方法同上述耐酸試驗(yàn)。計(jì)算存活率：

B/%=Y/Y0×100；

式中：B為豬膽鹽處理過的存活率；Y為處理3 h后每毫升的活菌數(shù)；Y0為對照組3 h后每毫升的活菌數(shù)。

1.8 抑菌試驗(yàn) 采用牛津杯法對所述乳酸菌菌株進(jìn)行抑菌活性測定。將指示菌大腸埃希氏菌、單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌按1%（V/V）接種量分別接種于LB、TSYEB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h備用。將乳酸菌菌株發(fā)酵液以1%（V/V）接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h備用。取滅菌培養(yǎng)皿，注入滅菌的MRS固體培養(yǎng)基15 mL，水平放置使之凝固，作為底層。放入已滅菌的牛津杯，將含有200 μL指示菌的20 mL的LB、TSYEB半固體培養(yǎng)基混勻，倒入平板，冷凝后取出牛津杯。在孔中加入200 μL乳酸菌菌液，于4℃擴(kuò)散4 h，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑，每個(gè)處理做3個(gè)平行試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)和生理生化特征 試驗(yàn)共分離了10株疑似乳酸菌菌株，它們在MRS瓊脂平板上為圓整、光滑、隆起、乳白色露滴樣小菌落。乳酸菌是指發(fā)酵糖類且主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱。由于3、4號和5號菌株革蘭氏染色呈陰性，故可認(rèn)定其不是乳酸菌。其余7個(gè)菌株形態(tài)及主要生化特征結(jié)果見表1。通過與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（第8版）中乳酸菌屬的描述相對照，初步鑒定1號菌株為鏈球菌屬，2號和8號菌株為乳桿菌屬，6、7、9號和10號菌株為片球菌屬。

表1 菌株的形態(tài)及主要生化特征

2.2 16S rDNA的序列分析 分離菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。由圖1可知，各分離菌株均得到一條清晰的條帶，與Marker相比，所獲得的擴(kuò)增片段大小在1500 bp左右，說明所得PCR產(chǎn)物為目的產(chǎn)物，可以純化后進(jìn)行測序。將7株試驗(yàn)菌株的長度大約為1500 bp的16S rDNA序列輸入到GenBank中，尋找與其同源性最高的菌株。7株乳酸菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物比對結(jié)果：菌株1與Streptococcus sp.的16S rDNA序列的同源性達(dá)到了99%，菌株2和8與Lactobacillus johnsonii的16S rDNA序列的同源性達(dá)到了99%，菌株6、7、9和 10與 Pediococcus acidilactici的 16S rDNA序列的同源性達(dá)到了99%。綜合主要生理生化特征與16S rDNA保守序列分析，鑒定結(jié)果為：菌株1為鏈球菌，菌株2和8為約氏乳桿菌，菌株6、7、9、10為乳酸片球菌。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.3 耐酸試驗(yàn) 成年母豬胃中的pH值較低，一般為2.0～3.0（張名濤等，2003），胃環(huán)境對細(xì)菌的破壞是依賴性的酸水解作用，因此微生態(tài)制劑必須有良好的耐酸能力，才能通過高酸性的胃環(huán)境而達(dá)到腸道發(fā)揮作用。食物通過胃的排空時(shí)間一般為2 h左右，本試驗(yàn)考察3 h內(nèi)菌株在不同pH條件下菌株的存活率（%），結(jié)果見表2。分離的菌株都表現(xiàn)出了較強(qiáng)的酸耐受性，pH 3.0處理后存活率均在36%以上，pH 2.5處理后存活率均在26%以上。即使在pH 2.0處理后，所有菌株對酸仍還有一定的耐受性，且均在18%以上。菌株對于耐酸性的能力：1＞7＞6＞2＞10＞9＞8。

表2 不同pH條件下菌株的存活率 %

2.4 耐膽鹽試驗(yàn) 乳酸菌進(jìn)入腸道后，小腸中膽鹽的高滲透壓環(huán)境不利于其存活。成年母豬小腸內(nèi)膽鹽濃度在0.03%～0.30%波動(dòng)。本試驗(yàn)考察3 h內(nèi)菌株在不同膽鹽濃度條件下菌株的存活率，結(jié)果見表3。分離的菌株都表現(xiàn)出了較強(qiáng)的膽鹽耐受性，0.1%膽鹽處理后存活率均在50%以上，0.2%膽鹽處理后存活率均在29%以上。即使在0.3%膽鹽處理后，所有菌株對膽鹽仍還有一定的耐受性，且均在15%以上。菌株的耐膽鹽的能力：8＞2＞9＞10＞6＞1＞7。

表3 不同膽鹽濃度條件下菌株的存活率%

2.5 抑菌試驗(yàn) 菌株對大腸埃希氏菌、單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌的抑制作用結(jié)果見表4。由表4可知，所有菌株對2株指示菌均有較強(qiáng)的抑制作用，對大腸埃希氏菌抑菌圈直徑為14.53～18.97 mm，而對單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌抑菌圈直徑為5.83～10.27 mm，即所有菌株對大腸埃希氏菌的抑菌效果均強(qiáng)于單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌。

表4 菌株對大腸埃希氏菌、單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌的抑制作用 mm

3 討論

近年來，微生態(tài)制劑在仔豬、育肥豬中研究和應(yīng)用的較多，但是在母豬生產(chǎn)中的研究和應(yīng)用相對較少，然而母豬在養(yǎng)豬業(yè)中占有很大的比重，母豬的健康直接關(guān)系著整個(gè)養(yǎng)豬業(yè)的生產(chǎn)效率 （李彪和楊乃歡，2009）。健康母豬腸道內(nèi)的微生物菌群彼此之間相互依存，相互制約，維護(hù)著母豬腸道內(nèi)菌群平衡。但是當(dāng)母豬懷孕后身體機(jī)能會(huì)出現(xiàn)一系列的變化，如果飼養(yǎng)管理、營養(yǎng)等各方面沒做好，會(huì)對產(chǎn)仔數(shù)和斷奶有重大的影響。規(guī)?；B(yǎng)豬場懷孕母豬最容易出現(xiàn)的問題是便秘、采食量低、產(chǎn)后奶水不足、免疫力下降等問題。另外，母豬腸道菌群的健康直接影響哺乳仔豬的健康。新生仔豬腸道是無菌的，當(dāng)其通過母豬產(chǎn)道、采食母乳、與環(huán)境接觸等腸道內(nèi)開始定植多種菌群。如果母豬腸道菌群失調(diào)，會(huì)有大量的有害菌隨糞便排入到環(huán)境中，從而增加了仔豬患病的機(jī)會(huì)。因此，開發(fā)研究供母豬應(yīng)用的微生態(tài)制劑具有重要意義。

乳酸菌作為微生態(tài)制劑可直接飼喂動(dòng)物，它以活菌形式在動(dòng)物消化道中與病原菌通過競爭性抑制作用增強(qiáng)機(jī)體免疫力，并直接參與胃腸道微生態(tài)平衡調(diào)節(jié)（陳紅梅等，2006）。然而乳酸菌在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用效果不顯著，益生作用變異范圍大，其中的一個(gè)重要原因是所用菌株在動(dòng)物腸道中難以存活（李太元等，2005），寄主和腸道菌群之間存在著相互選擇、相互依賴的關(guān)系，因而一種適于某類動(dòng)物的微生態(tài)制劑未必適于另一種動(dòng)物，因此理想的微生態(tài)制劑菌種最好來自同源動(dòng)物的腸道，只有這樣才能增強(qiáng)益生菌功效。因此，本研究以健康母豬糞便為樣本，分離并鑒定可作為微生態(tài)制劑的乳酸菌。

菌株分離是一項(xiàng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作，因此培養(yǎng)基的選擇至關(guān)重要，使用合適的培養(yǎng)基可以減少工作量，提高工作效率，加快研究進(jìn)度。本試驗(yàn)采用MRS培養(yǎng)基作為分離培養(yǎng)基，因其含有高濃度的乙酸鹽離子，并有刺激因子吐溫-80，可抑制其他微生物的生長，起到選擇培養(yǎng)的作用（林朝洪，2007），因而能從糞便這種復(fù)雜區(qū)系中選擇培養(yǎng)出乳酸菌。在整個(gè)培養(yǎng)過程中均采取有氧培養(yǎng)，分離出的乳酸菌均為堿性厭氧菌。

對菌株進(jìn)行有效、準(zhǔn)確鑒定是開發(fā)和利用它們的前提條件。生理生化特征是微生物分類的重要依據(jù)之一，理論上可以通過生理生化試驗(yàn)對菌株進(jìn)行鑒定。但是，利用生理生化特征對微生物鑒定是根據(jù)最大相似性的原則進(jìn)行分類，由于種間生理生化特征差異較小，并且一些生理生化特征因長期受到生長環(huán)境的影響會(huì)發(fā)生改變。而分子鑒定法中16S rDNA相對分子質(zhì)量適中，其基因核苷酸序列具有高度保守性。但它的保守性又是相對的，在保守區(qū)之間有9～10個(gè)變異區(qū)，不同科、屬、種間都具有一定的變異，可利用可變區(qū)序列的差異對不同菌屬、菌種的細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定。因此本試驗(yàn)將主要生理生化特征鑒定與16S rDNA保守序列分析相結(jié)合，增加了鑒定的可信度。

微生態(tài)制劑飼喂動(dòng)物后能否在動(dòng)物的腸道內(nèi)定植除了本身必須具備抑制有害微生物繁殖的特點(diǎn)外，還必須能夠耐胃腸道中的生理環(huán)境，在其中存活并繁殖（王玉華等，2006）。乳酸菌能在較低酸性環(huán)境下存活，與其自身具有耐酸保護(hù)機(jī)制有關(guān)，它能產(chǎn)生細(xì)胞質(zhì)緩沖物質(zhì)，合成酸或堿性物質(zhì)，向胞外運(yùn)送氫離子（暢天獅等，2002）。但是當(dāng)pH過低或過高時(shí)，乳酸菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，通透性和滲透壓升高，最終導(dǎo)致細(xì)胞破裂死亡。而豬胃液的pH與豬齡、飼料類型等因素有關(guān)，成年母豬胃液pH相對穩(wěn)定，為2.0～3.0，因此對于應(yīng)用于母豬的微生態(tài)制劑篩選的酸性條件，一般選擇pH為2.0、2.5和3.0。篩選微生態(tài)制劑要考慮的另一個(gè)重要因素是具備耐受小腸中膽汁形成的高滲透壓環(huán)境的能力。肝臟分泌到十二指腸中的高濃度膽酸鹽抗菌活性較強(qiáng)，對細(xì)胞膜有很強(qiáng)的破壞能力，其疏水作用可使乳酸菌細(xì)胞膜損壞。小腸中膽汁鹽含量在0.03%～0.3%，因此對于應(yīng)用于母豬的微生態(tài)制劑篩選的膽鹽濃度為0.1%、0.2%和0.3%。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從健康母豬糞便中分離純化出7株乳酸菌，分別為鏈球菌、約氏乳桿菌和乳酸片球菌；所有菌株在pH 2.0～3.0、膽鹽濃度0.1%～0.3%，均有較強(qiáng)的耐受能力；體外抑菌試驗(yàn)表明各菌株對大腸埃希氏菌和單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌均有拮抗作用，具備了益生菌的基本條件，為研究與開發(fā)微生態(tài)制劑奠定了基礎(chǔ)。

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